株式会社 同仁化学研究所 園田 晋也
活性酸素種（ROS）は癌、炎症、動脈硬化を始めとする様々な疾患を引き起こす酸化作用だけでなく、細胞内情報伝達などのシグナルメッセンジャーとしての役割を持つことが知られており、生命化学の幅広い研究領域で注目を集めている。
ROSの一種であるH2O2はスーパーオキサイド（O2-）のSODによる副産物として知られ、酸化ストレスの指標となっている。また、mitogen-activated protein(MAP) kinaseのようなリン酸化酵素、nuclear factor κB(NF-κB), activating protein 1(AP-1)のような転写因子、protein tyrosine phosphatases (PTPs)、ion channels、G protainsなど細胞増殖や細胞死を制御するシグナルタンパク質へのセカンドメッセンジャーとしての役割を担っていることも知られている。このような重要なファクターであるにもかかわらず、その発生、伝達、作用のメカニズムは明らかになっていない。
ROSの生体内での役割を明らかにするためにESR法、吸光光度法、蛍光光度法、化学発光法など種々の検出法が開発されてきた。その中でも、蛍光プローブをロードした生細胞を蛍光顕微鏡下で観測する方法（蛍光イメージング法）は、生きている状態での生物応答を感度良く、リアルタイムで、空間分解能高く捉えることが出来る点で優れており、近年注目されている方法である。
蛍光イメージングを行う際、検出対象分子を可視化する蛍光プローブの存在が不可欠であるが、最も使用事例の多いプローブは強い蛍光を発する色素を2電子還元した構造のロイコ染料である。代表的なものとしては2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン（DCFH）、ジヒドロローダミン123、ジヒドロエチジウムなどが挙げられる。これらのプローブは高い検出感度を持っているが、励起光をあてるだけで著しい蛍光強度の増大が起こり、また、全てのROSと反応するという選択性の乏しさが問題となっている。
最近、J. Changらは上記問題点を克服した蛍光プローブの開発を目指し、Fig. 1に示すBoronateの誘導体である3種類のプローブPeroxyfluor-1（PF1）, Peroxyresorufin-1（PR1）, Peroxyxanthone-1（PX1）を発表している1,2) 。
これらの蛍光プローブの特徴は、まず第一に高いH2O2選択性を持つことである。これは、Boronateの脱保護がH2O2に対して選択的に起こるためで、他のROSではBoronateの脱保護がほとんど起こらない。PF1の場合、NOに対して6倍以上、他のROS（TBHP: t-butyl hydroperoxide, O2-,NO+,･OH, ･OtBu, ClO-, O3, 1O2）に対しては100〜500倍以上の蛍光強度を示す。PR1の場合、TBHP, ClO-, 1O2に対して15倍以上、他のROSに対しては500〜1000倍以上の蛍光強度を示し、PX1の場合、NO+に対して6倍以上、ClO-, NOに対して60倍以上、他のROSに対しては100〜500倍以上の蛍光強度を示す。このような選択性は従来のプローブには見られないものである。
第二の特長は、高い光耐性を有していることである。細胞内にロードした後、励起光を照射しても、試薬による蛍光ブランクの上昇はほとんど見られない。前述の、DCFHをはじめとする既存のプローブは蛍光観察時の励起光照射により蛍光強度の上昇が起こるため正しい解釈が困難であったが、これらの蛍光プローブを使用することにより信頼性の高いデータを得ることができる。
第三の特長は、膜透過性を持ち、細胞内のH2O2をイメージングすることが可能ということである。J. Changらは、HEK細胞に各蛍光プローブをロードし、共焦点顕微鏡または、二光子顕微鏡で細胞内H2O2の蛍光イメージングを行っている。また、PF1を用い、海馬ニューロンのイメージングにも成功した。しかしながら、イメージング可能なのは μMレベルでの細胞内H2O2濃度の変化であり、H2O2の生体内での作用を解明するには必ずしも十分な感度ではない。
ここで紹介したBoronate誘導体は、H2O2選択性、光耐性、膜透過性を持ち合わせ、細胞内イメージングが可能という優れた性能を有している。今後、より高感度なプローブが開発されれば、生理学的、病理学的なH2O2のメカニズム解明に繋がることが期待される。
参考文献
1) M. C. Y. Chang, A. Pralle, E. Y. Isacoff and C. J. Chang and J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 15392.
2) E. W. Miller, A. E. Albers, A. Pralle, E. Y. Isacoff and C. J. Chang, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 16652.