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河野 雅弘 （Masahiro Kohno） 東北大学未来科学技術共同研究センター 量子生命反応工学創製部門 |
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河野 雅弘 （Masahiro Kohno） 東北大学未来科学技術共同研究センター 量子生命反応工学創製部門 |
[ Summary ]
スピントラッピング法と連結した電子スピン共鳴装置（Electron Spin Resonance：ESR）は活性酸素（ROSs）やフリーラジカル計測のための最も強力な手段である。それ故に1970年から今日まで、ESR測定は生物ラジカル研究において主要な観測手段として使われてきた。本稿では、この計測法が“生物ラジカル研究に対してどのように応用できるか”をあらためて紹介する。同時に、新たな応用展開が期待される新規スピントラッピング試薬について述べる。
An electron spin resonance spectrometer (ESR) coupled with spin-trapping method is the most powerful tool for observing reactive oxygen species (ROSs) and free radicals. Therefore, from the first stage of 1970s to now, ESR measurement has been used as main equipment for bio-radical research. In the present article, I introduce again to "how to applied for bio-radical?", and spin-trapping reagent which will be expected to new application deployment.
キーワード：活性酸素、フリーラジカル、ESR、スピントラップ剤
好気性生物の多くは生命維持活動のために大量の酸素を消費している。その過程において酸素由来の活性酸素や一酸化窒素(NO・)、二酸化窒素(NO2・)などを生成する。これらの分子種は、生命維持のメディエイターとしての役割を担っているが生体に障害を与える場合もあり生命科学の幅広い研究領域で関心がもたれている1,2)。
活性酸素とは、酸素がより反応性の高い分子種であるスーパーオキシド（
）、過酸化水素（H2O2）、ヒドロキシルラジカル（HO・）、一重項酸素（1O2）に変化した場合の呼称である。一方フリーラジカルは不対電子を有する原子または分子のことをいい、NO・、NO2・、、HO・などがある。フリーラジカルは反応性が高く、常温常圧では安定に存在する時間（寿命）が短いといった性質を示す。H2O2は比較的安定な分子種で、酵素反応の基質としての働きや酸素貯蔵の役割を担っておりフリーラジカルではない。1O2は、反応性は高いが不対電子を有してないのでフリーラジ
カルとは呼ばない。
生体内には図1に示すような活性酸素の生成系と消去系が共存している。活性酸素研究では試験管レベルでの実験結果を積み重ねて、生体障害等との因果関係を明らかにする努力が払われてきた。しかし生体内で生成する活性酸素種の特定や定量はなされておらず、推論や仮説の域を出ていない。活性酸素の体内挙動を明らかにするには、どの部位で、どのような分子種が、どのくらいの濃度(量)生成され、どのような作用(反応)をしているのかを観測する必要がある。そのためには、反応性の高いフリーラジカルを選択的に計測し定量する方法の確立が不可欠である。
一般的な活性酸素測定は発光・発色試薬を用いた化学発光分析計や蛍光分析計、吸光分光計で行われている。しかし、これらの計測では非特異的な発光や発色が観測されることが多く、図1中に示したミトコンドリア内の電子伝達系、白血球のNADPH酸化酵素系、血管内皮細胞のキサンチン酸化酵素系、肝臓組織のP450酸化酵素系などから生成する活性酸素種を特定して測定することは難しい。唯一、短寿命のフリーラジカルを選択的かつ定量的に測定することができる方法として、ESR-スピントラッピング法があげられる。生物ラジカル研究では最も信頼性の高い計測手段であるといえる3-6)。
本稿では、このESR-スピントラッピング法について紹介すると同時に、新しい特徴を持つスピン-トラッピング試薬の開発とその応用性について紹介する。
ESR測定には直接と間接の二つの計測方法がある。直接法は溶液中のフリーラジカルを瞬間的に低温にし、ラジカル反応を停止させて測定する方法である。そのため、ESRスペクトルが観測されるとフリーラジカルの直接証明となる。しかしこの方法は溶液を低温にするまでにフリーラジカルが消滅することがあり定量性に欠ける。この直接法の欠点を補う目的で考案されたのが短寿命のフリーラジカルを間接計測するスピントラッピング法である。スピントラッピング法は1960年代の後半 E. G. Janzenら数人によって提案された7-11）。本法は、図2に示したようにスピントラッピング剤（ニトロン化合物やニトロソ化合物）とフリーラジカル（R・）を反応させ（捕捉と呼ぶ）、共有結合によって安定なアミノオキシドラジカル（スピンアダクトと呼ぶ）を生じさせ、ESR分光装置で観測する方法である。スピンアダクトのESRスペクトルを解析することで捕捉されたフリーラジカル種の特定と定量ができる。
フリーラジカルの特定はESRスペクトルの解析によって行われる。スペクトルの解析は、ESRパラメータと呼ばれるg値（信号の観測される磁場の強度と共振周波数で決定される）と超微細結合定数（Hfcc:aで表す）によって行われる。HfccはESRスペクトルの分裂を表す測定値（パラメータ）で、スピンアダクトが示すスペクトルの分裂の仕方によって決定される。直接法とは違ってスピンアダクトのスペクトルは単純な分裂を示すことが多く解析も容易である。
超微細分裂（HfS）を示す原子は、窒素（N）、水素（H）、重水素（D）、リン（P）など限られている。Hfccはスペクトルの分裂幅を示しており、分裂の大きさは磁場の強さ（mT）で表示され、aN, aH, aPなどと表される。、HO・、アルコキシラジカル（RO・）、 パーオキシルラジカル（ROO・）、炭素ラジカル（C・）などのスピンアダクトのHfcc値が論文にまとめられている12)。
Hfccやg値の他に、波形（ガウス型、ローレンツ型）、分裂したスペクトルの数、分裂した信号の強度比が解析に使われる。
フリーラジカルの量（濃度）はスピンアダクトのESRスペクトルの積分値（面積）から求めることができる。ESRスペクトルは波形が微分形であるので面積を求めるには2回積分する方法が取られている。最新のESR装置には積分値をスピン数（フリーラジカルの数、量）に変換するプログラムも内蔵されているのでこれを用いるとよい。安定な既知のフリーラジカルを標準物質として用い、スピンアダクトから求められた面積を標準物質の面積と比較することにより定量ができる。この方法では、スピントラッピング剤が生成するフリーラジカルを100％捕捉していること、捕捉したスピンアダクトのスペクトルが安定であることの確認が必要となる。
ESR-スピントラッピング法の特徴についてまとめてみた。
利点は、
1．スピントアダクトのESRスペクトルが観測されることによって、化学反応系あるいは生物反応系にフリーラジカルが生成していることが確認できる。
2．スピンアダクトのESRスペクトルを解析（g値、超微細結合定数：Hfcc、a値、線形、線幅）することで、フリーラジカルの特定ができる。
3．スピンアダクトの面積を求め標準物質との比較により、フリーラジカルの間接定量ができる。
4．スピンアダクトの量を指標として速度論的な解析を行い、フリーラジカル反応における生成速度や消去速度が求められる。
一方、欠点は、
1．トラッピング剤と反応する前に、フリーラジカルが同種あるいは他の分子種と反応するとスピンアダクトが生成せず測定ができない。
2．スピンアダクトが二次反応により短時間で消失することがある。
3．スピンアダクトが分解して新たなスピンアダクトを生成させ、定量的な誤差が生じる。
4．スピンアダクトのESRスペクトルからもとまる超微細結合定数（Hfcc）は、スピンアダクト分子の局所における電子密度と構造に関係していて、捕捉したフリーラジカルの分子内の電子分布や分子構造に関係する直接情報が得られない。
などである。
ESR-スピントラッピング法が生物ラジカル研究に本格的に応用されたのは1970年代半ばからである13-14）。スピントラッピング法の開発初期には試薬は市販されていなかったので比較的合成が簡単なニトロン系のPBNやPOBNなどを使って研究がなされた。
図3には代表的なスピントラッピング剤であるニトロソ系とニトロン系の化合物の構造を示した。ニトロン系試薬はスーパーオキシドやヒドロキシルラジカルなど酸素ラジカル（活性酸素）の計測に、ニトロソ系の試薬は炭素ラジカル、窒素ラジカルの測定に用いられる。
生物ラジカル研究でスピントラッピング剤に要求される特性として、水に対する溶解度が高いこと、溶解後に試薬が安定であること、捕捉するラジカル分子への選択性が高いことなどがあげられる。反応性については研究分野や用途によって異なってくる。例えば、フリーラジカルの生成過程を捉えるには反応性が高いことが望まれ、一方、消去活性の測定では反応性が低いことが要求される。さらに、スピンアダクトの寿命が長く、ESRスペクトル解析が容易であることも理想的なスピントラッピング剤の条件となる。
生物ラジカル研究で使われる代表的なスピントラッピング剤が5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide(DMPO)である。DMPOが多用されている理由は、活性酸素由来のDMPO のスピンアダクトのESRスペクトルの解析が容易であった、高純度の試薬が
㈱同仁化学研究所で 開発され安定的に供給された、初心者が容易に扱えたなど利便性がすぐれていたことによる。しかし、DMPOも万能ではなく、試薬の安定性や2次分解など計測上の問題を抱えている。そのため、新規のスピントラッピング試薬開発の期待は大きい。後で紹介する新規試薬は生物ラジカル研究の応用に有望であるが、試薬の特性をよく理解し、実験の手技を熟知してなければならないことは従来と同様である。
生体ラジカル種の特定に消去物質による競争反応を使って行われることがある。図4の上段はキサンチン酸化酵素系で生成する、のスピンアダクトDMPO-OOHの信号である。ESRパラメータによって同定が行われるが、生化学的にはスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を反応系に添加し、SOD濃度に依存したESRスペクトル強度の減衰を調べ、スピンアダクトが由来の信号であることを確認している。他のフリーラジカルについても同様の方法が使われる。
スピントラッピング法が開発された1970年代には放射線照射下で生じるアミノ酸のラジカルや有機ラジカル、過酸化物から生成する酸素ラジカルの計測がおこなわれた。同じ頃に、活性酸素研究に関係する過酸化水素から生成したとHOO・の観測例が報告されている。また、スピンアダクト定量が可能になって、速度論を展開することができるようになった。その後、アミノ酸の放射線照射の研究は積極的に進められアミノ酸の分解物の同定などが行われた。他にも、核酸や塩基の酸化反応、フラビンの光反応、アミノ酸
分解、ペプチドおよび核酸の放射線照射、脂質過酸化反応あるいは薬物の活性化、抗炎症剤の研究に幅広く利用された8-11）。
活性酸素の研究が重要であると認識されるようになったのはフリードビッチによるSODの発見以降で、活性酸素を産生する酵素や好中球の刺激後の生成の測定に利用された。
活性酸素の計測にDMPO が多用されたのは、捕捉するフリーラジカルの違いにより違なるESRスペクトルを与え、スペクトルの解析が容易であったことによる。図5は、HO・、水素原子（H・）、炭素中心ラジカル（C・）のDMPO スピンアダクトの典型的なESRスペクトルを示している。PBNやPOBNを使った場合、それぞれのスピンアダクトスペクトルが類似しており、ラジカル分子種が違っても解析が容易でない。
5．スピントラッピング法の高度利用
5．1 速度論的解析
ESR-スピントラッピング法が動的計測法（kinetic method）になることは1974年に報告された。フリーラジカルの捕捉量はスピントラッピング剤の反応速度（k）と試薬濃度（C）の積で決まる。そのため、フリーラジカルの生成が少ない条件下や反応性の低いフリーラジカルの計測では、より高濃度のスピントラッピング剤を用いねばならない。DMPOの反応速度を例にとると、を捕捉する反応速度は16 M-1s-1と反応性が低く、酵素反応で生成するを確実に捕捉するには高濃度DMPO（1M以上）を用いる必要がある。酸性条件下で、DMPOとHOO・の反応速度は6.6x103 M-1s-1との報告がある。一方、HO・に対するDMPOの反応速度
は、3-5x109 M-1s-1である15）。発生系のHO・量にもよるがDMPO濃度を0.1ｍM以上にすると、HO・がほぼ100％捕捉できる。
DMPO-スピントラッピング法を使ってキサンチン酸化酵素（XOD）やNADPH酸化酵素などの酵素反応速度を求めることができる16,17)。XOD反応において、基質であるヒポキサンチン（HPX）の濃度を変化させて1分間に生成するの量を求め、図6に示したようにLineweaver-Burkプロットすることで、酵素反応速度と解離定数（Vmaxとkm）が求まる。
フリーラジカル消去力の測定は、図7に示したようにスピントラッピング試薬とフリーラジカルに対する反応物質(消去物質)との競争反応を利用して測定される。表1はに対する消去力を速度論的に解析した結果を示した。HO・の消去力についても同様の研究がされている。ESR法ではこの二つの消去力を、スーパーオキシド スカベンジング アビリテイ（SOSA）とヒドロキシラジカルスカベンジング アビリテイ（HRSA）と呼ぶ18-20)。
SOSAの測定は、体液（血液，髄液，尿）や皮膚組織、臓器などに応用できる。また、抗炎症剤、抗酸化剤、漢方薬剤などの測定もできる。
SOSAの測定値は、未添加のESRスペクトルが50%消去される濃度（IC50）で表される。
表1はSODを標準試薬とし各種薬剤の消去活性を測定しているが、SODの消去能が他の物質に比べ、飛びぬけて強い。
さらに、IC50の値を使って、速度論的な取り扱いができるので、表1のようにSOSAを反応速度定数として求めることもできる。
反応速度定数を求める計算式は、スピントラッピング剤（DMPO）と消去物質（S）が共存している系を想定して記述される。反応系から一定量のが供給されると、はDMPO, Sの両方と反応して2種類の反応中間体を生じる。
+ DMPO 
DMPO- （式1）
+ S 
S- （式2）
ここで、k1，k2は各反応速度定数である。すると、反応速度式は次のようになる。
d[DMPO-] / dt = k1 [DMPO][] （式3）
d[S-] / dt = k2 [S][] （式4）
式（3）と式（4）からDMPO-の減少量は、消去物質によって奪われるの量と等しいはずであるから、2つの反応式には次の関係が成り立つ。
d[DMPO-] / dt ：d[S-] / dt = (1-X) ：X （式5）
ここで変数XはDMPO-の減少率（0＜X＜1）を表す。式（3）から式（5）を整理すると,次の式が得られる。
k2 = k1｛X / (1-X)｝・｛[DMPO] / [S]｝ （式6）
DMPO-が50％減少する場合（X=0.5のとき）式6は更に簡略化される。
k2 = k1 [DMPO] / IC50 （式7）
このように、フリーラジカル消去活性は、IC50で表示される場合（相対値）と速度定数（絶対値）で表される場合がある。
HO・の研究もと同様で、発生系と消去系の研究がある。生成系としてはフェントン反応がよく知られている。DMPO を使って、フェントン反応で生成するHO・の定量が行われ、フェントン反応の反応速度を求める試みが山崎らによって行なわれている。同じように、超音波照射によって水の分解で生成するHO・の定量も、牧野らによって報告されている。様々なHO・消去物質の反応速度が決定されている21-22)。
新しいスピントラッピング剤の開発は、スピントラッピング法が生物ラジカル研究に応用されていることが多いこともあって、DMPOの類縁化合物の合成を中心に進められている。
図8には、DMPOおよびその類縁化合物とスピンアダクトの構造を示している23-26)。
新規スピントラッピング剤の分子設計を行うに当たり，スピントラッピング剤の機能として、スピンアダクトの寿命、反応速度が重要である。つまり、新しい試薬はDMPOに比較して、に対しては反応性が高く、HO・に対しては低いといった相反する反応性が求められる。さらに、多くのアダクトの寿命が長く、解析が容易である必要もある。加えて、試薬の価格が安価でないと幅広く研究に用いることができない。
これらの要求を満足させる新たなスピントラッピング剤として開発されたのが、DMPO類縁化合物であるDPPMPOである。図9には、XOD系で生成するとフェントン反応で生成するHO・のESRスペクトルを示した。DMPOの信号に比べると、スペクトルは複雑であるが、解析は容易である。Hfccは表2に示した。試薬に求められるのはスピンアダクトの寿命で、短寿命のフリーラジカルの定量性を高めることができる。表3には、DPPMPOに捕捉されたスピンアダクトの寿命を半減期で表したが、DMPOに比べると、寿命は8倍であった。次にとHO・に対する反応速度を表4に示した。DPPMPOは反応速度がDMPOの3倍で、捕捉率も高いことが分かった。これらの特徴はスピントラップ法の新たな応用展開を可能とする。DPPMPO試薬は結晶であり、DMPOのように長期保存による分解が起こらない、さらに溶解させた後の試薬が長期安定であるなど、従来の試薬にない
特徴を有している。
7．まとめ
本稿ではESR-スピントラッピング法の説明と生物ラジカル研究への応用について述べた。活性酸素研究の多くはDMPOによってなされてきたが、この試薬の欠点を補うスピントラッピング剤の開発が進められ、新しい試薬の開発が実現しつつある。新たに開発されたDPPMPOが安定に供給されることになれば、活性酸素・フリーラジカル研究への利用が期待できる。特に、白血球細胞や培養がん細胞、皮膚表面の炎症誘発物質などに活性酸素生成の測定が可能となる。
今後、多くの生物ラジカル研究者が新しい試薬を武器として、新しい発見をされることを期待したい。
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著者紹介
| 氏名 | 河野 雅弘（Masahiro Kohno） |
| 所属 | 東北大学未来科学技術共同研究センター 量子生命反応工学創製部門 |
| 連絡先 | 〒980-8579 宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉6-6-10 TEL: 022-795-4113 FAX: 022-795-4110 E-mail:mkohno@niche.tohoku.ac.jp |
| 出身大学 | 愛媛大学文理学部化学科 |
| 学位 | 博士（理学、医学） |
| 研究テーマ | 磁気分光学（ESR）、生物物理学、環境科学 |
| 著書 | 活性酸素・フリーラジカルのすべて（丸善）、水と活性酸素（オーム社）、わかりやすい抗菌・殺菌の基礎知識（オーム出版）、電子スピン共鳴装置（オーム出版）、強酸性電解水の基礎知識（オーム出版） |
