蛍光標識用キット

Q1 IgG以外のタンパク質にも標識することはできますか？

A1 分子量50,000以上のNH₂ 基をもつタンパク質であれば標識できます。低分子はチューブの膜を通過するため標識できません。

Q2 使用できるIgGが少量しかないのですが、標識できるでしょうか？

A2 使用できるIgGの量は50〜200 μgとしています。この範囲であれば性能に大きな違いはみられません。

10 μgのIgGでも標識可能ですが、バックグラウンドの上昇などの問題が生じる可能性があります。

Q3 サンプルは溶液になっていても問題ないでしょうか？

A3 問題ありません。

ただし、チューブ上で遠心や反応溶液の添加を行いますので、サンプル溶液の容量は100 μl以下にしてください。また、サンプル(IgGなど)の濃度が50 μg/100 μl以下である場合は、Filtrationを繰り返してタンパク量が50〜200 μg/100 μlとなるように濃縮します。溶液をFiltration tubeに入れて遠心して溶液を除く操作を数回行ってください。

フィルター上に残っているサンプル量が50〜200 μgとなればよいので、改めて溶解させる必要はありません。

Q4 サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか？

A4 共存物の種類により影響することがあります。

溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるタンパク質の精製を行い、標識反応にご使用ください。

＜高分子：分子量1万以上＞

影響する可能性があります。

BSAやゼラチンなど高分子でアミノ基をもつ化合物は、Fil tration Tubeでも除くことができません。そのため標識され、蛍光性不純物として影響します。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。

一方、アミノ基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。

＊Fluorescein Labeling Kit-NH₂ に限らず他のLabeling Kit に関しても同様の注意が必要です。

Q5 添付の保存バッファーでなくとも標識体の保存はできますか？

A5 可能です。

実験系の条件にあったバッファーに溶解し保存してください。ただし、標識後の安定性に関しては小社安定性データをそのまま利用することはできませんので別途、安定性をご確認下さい。

Q6 キット自体を冷凍保存してもよいですか？

A6 キットをそのまま冷凍保存しないでください。

NH₂-Reactive Fluoresceinのみを冷凍して、他は冷蔵してください。

冷凍保存すると性能に影響する部品があります。

例えば、Filtration Tubeは、凍結するとメンブランにクラックや割れが生じて、濾過能力に影響します。

また、バッファーも冷凍することにより、緩衝能に影響する可能性があります。一度凍結されるとキットの性能を保証できなくなりますので、ご注意ください。

Q7 NH₂-Reactive FluoresceinはDMSOに溶解後、保存できますか？

A7 長期の保存はできません。反応直前に溶解し、すぐに使用してください。

DMSOに含まれる水分によりNH₂ -Reactive Fluoresceinが徐々に加水分解され、標識率が低下する可能性があります。

Q8 プロトコルの操作方法で、IgGにはいくつ蛍光基が導入されますか？

A8 IgG 1分子に対し、Fluoresceinが4〜7個 導入されます。

Q9 プロトコールの操作で未反応の色素は除去できますか？

A9 NH₂-Reactive Fluoresceinは低分子であるため、Filtration tubeでほとんど除くことができます。

ただ一部の未反応や分解したFluoresceinが若干残ることがあります。除きたい場合には、さらに2回ほど洗浄してください。ただし組織染色などで使う場合は、壊れた色素による吸着などの問題はないと考えられます。

Q10 それぞれのモル吸光係数から標識率を算出する時に [0.22]がかけてありますが、この数値は何でしょうか？

A10 Fluoresceinの標識率の式は下記の通りです。

60,000は500 nmでのFluoresceinのモル吸光係数で、右辺の分子はFluoresceinのモル数になります。

Fluorescein は280 nmと500 nmに吸収があり、280 nm/500 nmの比が[0.22]です。280 nmの吸光度は「タンパク質の吸光度＋Fluoresceinの吸光度」となっていますので、 500 nmの吸光度に0.22を掛けたもの引くことにより、タンパク質のみの吸光度が求められます。この吸光度をモル吸光係数で割ることで、分母はタンパク質のモル数となり、タンパク質1分子あたりに導入されたFluoresceinの個数として算出されます。

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標識用キットシリーズ

　Dojindo Labeling Kitsは活性化試薬とFiltration tubeにより、抗体等を簡単に標識するためのキットです。

　標識方法としてはアミノ基標識用のNH ₂タイプとスルフヒドリル基標識用のSHタイプの2種類のキットがあります。NH ₂タイプはN-hydroxy succinimide (NHS)で活性化した試薬を用いており、タンパク質等のNH ₂基に標識することが出来ます。SHタイプはmaleimide基で活性化しており、還元抗体などSH基を有 するサンプルへ標識することができます。

　前処理-反応-精製まで全て一つのFiltration tube上で行うことができ、3時間以内に標識体が得られます。1回の標識操作で50 〜200 mgのサンプルを処理することができます。Filtration tubeを用いた精製はゲルろ過や透析などに比べ標識体の回収率が高く、 貴重なサンプルの標識に適しています。キットには保存溶液が付 属しており、標識体を安定に保存することができます。また、得 られた標識体は、免疫組織染色、ELISA、ウエスタンブロッドな どの様々な用途に利用することができます。Peroxidase、Alkaline Phosphatase、ビオチン、蛍光など各種キットをシリーズで取り 揃えておりますので、ご利用ください。

<免疫組織染色例>

Fluorescein Labeling Kit-NH₂を用いてマクロファージに発現するレセプターに対する抗体を標識し、マウス肺を染色した。レセ プター発現部位が特異的にFluoresceinによって染色された。

　 （画像提供：熊本大学医学部細胞病理学講座　寺崎泰弘先生）

Fig. マウス肺の組織染色画像

a）マクロファージに発現するレセプターの抗体をFluorescein Labeling Kit-NH₂で標識した標識抗体で染色

b）マクロファージのマーカーで染色

c）核染色

d）多重染色画像