九州大学工学研究院応用化学部門
片 山 佳 樹
前回、プロテインアレイの内、タンパクの発現パターン変化を解析するためのアレイについてご紹介した。今回は、タンパクの機能解析、すなわち、タンパク間相互作用やタンパク−核酸、タンパク−小分子などの相互作用、酵素活性などを直接評価するためのアレイについてご紹介する。Protein-function array (Kodadek)、Functional proteomics (MacBeath)等と呼ばれるものである。タンパク検出用アレイと異なり、この場合には非常に多種類のタンパクを同一基板上に固定化しなければならない。機能解析用プロテインアレイにおける最大の難関は、このタンパクの固定化である。一方、アレイに相互作用させる対象分子は、比較的簡単に検出用の標識を施せるので、検出過程は比較的容易であろう。
ヒトをはじめ、幾つかの生物で全ORFやcDNA配列が解析されてきた現在、原理的には、全タンパクを取得する事が可能である。しかしながら、これらを受けて、すぐにゲノム情報の利用が可能になるわけではない。例えば、ヒトに先立ってゲノム配列解析が修了した酵母でも、いまだ49％の遺伝子の機能は未知のままである1）。また、タンパクの場合、構造と機能（活性）の間に明確な関連性が無い場合も多い2）。ゲノム情報を実際に利用する際には、個々のタンパクの機能解明が不可欠である。しかしながら、全く機能が未知であるタンパクの機能を解析する事は容易なことではない。タンパクの細胞内における機能推定に有用な手段として、当該タンパクに結合するタンパクやその他の分子の特定がある。
タンパク間相互作用の解析法としては、Yeast Two Hybrid Systemが感度のよい方法として知られる3）。本手法は、タンパク間相互作用をレポーター遺伝子の発現シグナルで増幅できるため高感度で、また、ゲノムワイドに行う手法も検討されている。しかしながら、タンパクが転写因子との融合タンパクとしてしか扱えない事や、マルチコンプレックスには適用できない事、転写アクチベータや毒性のあるタンパクには適用できない事、細胞内であるので、条件設定や統一が困難などの欠点がある。免疫沈降法の利用は、マルチコンプレックスにも適用できる手法だが、対象タンパクが様々なタンパク複合体にあることが多く、解析が困難である4）。アフィニティークロマトグラフィーやGST pull-downアッセイなどの手法もあるが、ゲノムワイドに行うには不向きである。タンパク−核酸相互作用では、ゲル電気泳動法を用いたゲルシフトアッセイ5）やフットプリント法6）がある。これらの手法もハイスループット化が問題である。これに対し、多くのタンパクを同一基板上にディスプレイしたアレイは、対象分子との結合を直接観察でき、しかも、pH、イオン強度、タンパクの修飾状態、他の因子の有無などの種々の条件を制御できるため、非常に有望な手法となりうる。また、現在、ほとんどよい方法のない、ハイスループットな小分子の結合アッセイにも適用できるため、薬物スクリーニングなどその利用価値は広範である。
機能解析用プロテインチップでは、基板上に非常に多種類のタンパクを固定化する必要がある。したがって、それらのタンパクをある程度の量、取得せねばならない。原理的には、発現ベクターにcDNAを組み込み、タグ付タンパクとして大腸菌などで発現後、アフィニティー精製すればよいが、ゲノムワイドに行うのは非常に大変であろう。それでも、Invitrogenでは、GALプロモーターとヒスチジンタグを組み込んだベクターを用い、酵母の2000種のタンパクを取得しているし7）、Martzenらは、酵母の85％のORFをGSTとの融合タンパクとして得ている8）。同様の手法で、Zhuらは6200種といわれる酵母のタンパクの5800種を既に取得し9）、予想されるプロテインキナーゼ122種の内、119種を取得している10）。今後は、アフィニティータグ配列を付加したプライマーとプロモータ付プライマーを用いてPCRによりcDNAを得た後、in vitroタンパク合成法などを用いる方が簡便かもしれない。
機能解析用タンパクアレイでは、取得したタンパクを基板上に固定することが不可欠である。しかも、固定後、タンパクがその機能を維持している必要がある。しかしながら、タンパクはそれぞれ全く性質が異なり、基板表面との相互作用も異なるため、これは容易なことではない。さらに、理想的には、固定化したタンパク各々が同一の反応性を確保するため、タンパクの向きを揃えて固定化することが好ましい。100種類のタンパクがあれば、100種類の固定化法が必要だという研究者もいるくらいである。
固定化法として最も原始的なものは、ニトロセルロース膜11）やPVDF膜12）にタンパクをドットブロットの要領でスポットする物理吸着法である(Fig.1(a))。転写因子などある種のタンパクでは、ある程度の活性を維持できるようであるが一般性は乏しい。しかしながら、抗体のスクリーニングなどに用いる場合は、固定化したタンパクが変性していても差し支えないので、この手法で十分である。ただし、一般にタンパクは金属やガラスなどの固体表面との接触で変性しやすいため、何らかの表面修飾が必要である。自己組織化膜(SAM)の利用は、基板表面を自由に修飾でき、利用価値が高い(Fig.1(b))。ただし、一般的なSAMはアルキル鎖などの会合により疎水場を形成するので、そのままではタンパクにとって変性しやすい場を与える。したがって、PEG等をSAMと組み合わせて用いることにより親水性の場に転換してやる必要がある。タンパクの変性の問題を軽減する手法としては、スライドガラス上に厚さ10〜100 μmのポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにタンパクをスポットする手法がある(Fig.1(c))13,14）。この場合、タンパクは3次元空間に吸着するため、固定化量は2次元表面への手法に比べ、100倍以上が可能である。また、タンパクを多孔性ポリアクリルアミドゲル内にアミノ基を介して固定化する方法もある15）。
タンパクを表面に吸着させるだけでは、機械強度に問題があるため、一般にはタンパクを何らかの形で基板上につなぎとめる必要がある。そのような手法として最初に報告された方法は、Schreiberらのアルデヒド修飾スライドガラスの利用であろう(Fig.1(d))16）。この場合、タンパクのリジン残基などのアミノ基を介して直接固定化することもできるが、Schreiberらは、まずBSAの様なタンパクを固定化しておき、タンパク表面層を形成させておいて、さらにBSAのグルタミン酸残基などを利用した活性エステルを形成させ、これにタンパクを反応させて固定化する手法を用いている。SAM等の末端に活性エステルを配して、タンパクを固定化することも可能である(Fig.1(b))。また、アミノ基を利用した固定化としては、ガラス表面をエポキシ基で修飾し、これにタンパクを固定化する手法もある10）表面のアミノ基を固定化反応に用いると、タンパクの活性が損なわれる事が多く、また、タンパクの向きをそろえることができないなどあまりよい方法とはいえない。
これに対し、タンパクを発現する際、何らかのタグを付加しておけば、そこを基板への固定化に用いることで、基板上でのタンパクの向きをそろえることが可能である。しかも、固定化反応はタンパク本体と別のところで起こるから、活性への影響も最小限に抑える事ができる。このような手法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板への固定化する方法がある(Fig.1(e))9）。この場合、タンパクの活性は比較的よく保たれる。Zhuらの酵母タンパクアレイでも5800種の酵母タンパクを固定化して、約80％が活性を保っている。我々も、この手法を用いてエストロゲン受容体や転写因子を金電極上に固定化しているが、活性はおおむね良好に保たれるようである17,18）。ただし、ニッケル錯体は荷電を有しているため、これに作用させるサンプル中の種々の物質や、対象タンパクが非特異吸着をすることがしばしば見られることが欠点である。これに対し、さらに強力な結合であるビオチン−アビジン相互作用を用いる手法も検討されている19）。アビジンは毒性を有するタンパクであるため、基版にビオチンを固定化して、固定化するタンパクにアビジンを融合して発現するのは好ましくない。そこで、基版をアビジンでコートしておき、ビオチンをタンパクに修飾する事になるが、ランダムに標識するとタンパクの変性や、固定化方向の統一性が取れなくなる。Yaoらは、インテインを利用してビオチンをタンパク発現時にカルボキシ末端のみに標識する手法を報告している(Fig.1(f))20）。インテインは、遺伝子から発現する際にその両端にある遺伝子からのタンパク同士を結合する性質を有しており、この性質を利用してインテイン遺伝子の両端に目的タンパクとマルトース結合タンパクの遺伝子をそれぞれ結合して発現させる。すると、目的タンパクとマルトース結合タンパクがシステイン残基を介してチオエステル結合で融合したタンパクが得られる。これをキチンカラムでアフィニティー精製してキチンに捕捉させておき、これに末端システイン型のビオチン誘導体を作用させると、チオエステル部分で自発的に組換えが起こり、結果的に目的タンパクのC末端にビオチンがペプチド結合により導入される。この手法を用いるとビオチンを介してタンパクを同方向に固定化できる。以前ご紹介したように、タンパクの末端への小分子の標識は、この他にもピューロマイシンを用いた手法でも可能である。これらの手法は非常に興味深い方法であるが、標識効率を如何に挙げるかがポイントである。同様の戦略として、ある温度以上でヘリックスを形成し、互いに凝集する性質のある感熱性のタンパクを融合して発現させ、同じタンパクで修飾した基板上に、このタンパクの会合性を利用して固定化する方法もある21）。この場合、温度変化により固定化したタンパクを可逆的に脱着できるのが利点であるが、どの程度のタンパクに適用できるのかは不明である。エピトープタグを融合して発現させ、それに対する抗体で修飾した表面に固定化するなどの手法も考えられる。
機能解析用プロテインアレイとして最初の例は、ニトロセルロース膜状にタンパクをスポットしたユニバーサルアレイである。Ge11）は、転写因子など48種類のタンパクをメンブレンにスポットし、アッセイしたいタンパクをGSTとキナーゼ基質ぺプチド(RRASV)を融合して発現し、心筋キナーゼと32P-γ-ATPによりペプチド部分のセリンをリン酸化することで32P標識し、メンブレン上にスポットしたタンパクとの結合性をオートラジオグラフィーでアッセイしている。対象分子がDNAの場合は、クレノーフラグメントと32P-dCTPで3'末端を32P標識している。ただし、この手法ではディスプレイできるタンパクの数と変性しないで用いる事のできるタンパクの種類に限界がある。その後、より一般性があり、高密度にスポットが可能なアレイとしてゲルパッドをガラス基板に接合した種々のアレイが報告された13,14）。酵素などの固定化においては、比較的活性がよく保たれるという。
これに対し、よりDNAアレイに近い集積度を有するプロテインチップとして、市販のアレイヤーでタンパクをスポットし、蛍光スキャナーで解析できるアレイが報告されてきた9,16）。これらは、前述のアミノ基や、ヒスチジンタグを介した固定化法でガラス基板上に固定化される。この手法では、スポット辺りnL程度の溶液として数千〜1万種のタンパクを固定化できるのが最大の利点である。酵母のタンパクでは、比較的活性が保たれるものが多いが、やはり20％ほどは不活性化するようである。検出は、蛍光標識したタンパクや小分子を用い、得られた蛍光強度から結合の程度を推測する。Zhuらは、こうして作成した酵母タンパクアレイに、カルモデュリンやリポソームを作用させ、33種の未知のカルモデュリン結合タンパク、150種のリン脂質結合タンパクを見出している9）。また、ポリジメチルシロキサンを素材として18 mm×28 mmに直径1.4 mmのウェル（300 μL）を10×14作成し、表面をエポキシ基で修飾し、これに種々の基質タンパクをアミノ基により固定化して、GST融合タンパクとして発現した酵母のプロテインキナーゼ119種類を作用させ、リン酸化を32Pを用いて評価した例では、これまで知られていなかったチロシンキナーゼの可能性のあるキナーゼが7種類見つかっている10）。
この様に、この種のアレイでは、対象とするタンパクが結合する相手を迅速かつ網羅的に直接評価できるため、タンパクの機能解析には極めて有効である。また、小分子との相互作用の評価例では、125Iで標識したトリヨードチロシンを用いた例がある11）。
プロテインアレイを開発する場合、表面化学に対する知見があまりにも乏しいことが開発を困難にしているが、それにも増して、一体どの程度のタンパクが固定され、それに作用させたタンパクがどの程度結合したのか、さらに検出に標識抗体などを用いる場合には、さらにどの程度の効率で（形成した複合体のどの程度が）検出されているのかといった事を評価するのが極めて困難であり、定量性の議論を妨げている。
Levit-Binnunらは、アルデヒド修飾基板に固定した(BSA)に対し、ビオチン化抗BSA抗体を結合させるモデル系を用いてこの問題に対しアプローチしている22）。検出は、金コロイド標識ストレプトアビジンを用い、走査型電子顕微鏡で検出している。固定化したタンパクをP、作用させる標的分子をMとする。ここで、サンプル溶液中でPと出会えるMの分子数をmvとすると、Pに結合したM（すなわち、形成された複合体）の分子数 msは、PがMより過剰の場合には、ms＝mvαで表される。mvは、半径rのディスク（スポット）に関する拡散方程式から計算できる。mv＝It=4DrA[M]（D：拡散係数、[M]：バルク溶液中のMの濃度、A：アボガドロ数、I：拡散流）。ここで、例えばMとして抗体を用いているが、D＝3.8×10-7 cm/s23）、rは200 μm、3時間作用させたとすると、mv＝1.98×1017 となる。αは、基板表面で複合体が形成される効率であり、これが分かれば、サンプル溶液のタンパク濃度が分かり基板表面で形成される複合体数が分かる。αは、用いる系に固有の値であり、反応基の表面被覆率やその上のPの固定化率、PとMのKdなど多くの因子で形成される。一方、検出効率をβとすると、検出される分子数mDは、mD＝msβ＝mvαβとなる。よって、全プロセスでの検出効率は、αβで表される。すなわち、作用させるタンパクの濃度を変化させて、mDとmsをプロットすれば、傾きからαβが求まる。もし、作用させるタンパクMを直接蛍光標識などした場合では、βは1となり、この実験でαが求まる。
タンパク機能評価用のプロテインアレイは、直接タンパクと対象分子の結合を評価でき、しかも、標的分子としてタンパク以外にも核酸や小分子なども自由に用いる事ができるため、多くのタンパクが取得できれば、非常に有効な方法となる。しかしながら、多くのタンパクを変性させずに、しかも、互いに決められた量、決められた効率で固定化することは極めて困難である。今後、膨大な表面化学に関する基礎検討と、理論的検討、基板の加工法検討などの知見が蓄積されて初めて、理想的なプロテインアレイが開発できるものと考えられ、まだかなりの時間と開発費用を要するものであると考えられる。一方、タンパク検出用プロテインアレイのところでも指摘したように、タンパクは決して1：1の相互作用をするものではなく、細胞内では既に、マルチコンプレックスを形成している場合が多い。この様な場合、プロテインアレイを用いた結果が、はたして真の標的タンパクの機能的な姿を反映しているかどうかは依然として問題の残るところであることは承知しておく必要がある24）。
プロテインアレイは、潜在的な能力は疑う余地のないところであるが、開発上の多くの問題を抱えており、実用化にはまだ時間を要する。最近、薬物標的として利用しやすい膜タンパクに対してリガンド結合や機能評価を行うためのチップが種々検討され始めており、興味深い結果が出てきている。次回は、この様な膜タンパクに対するプロテインチップ開発に関してご紹介する。プロテインチップは、DNAチップでは不可能な事にこそ用いるべきであり、最近、翻訳後修飾や小分子結合、活性変化等を対象にしたアレイの検討がなされている。そのような中で、ペプチドアレイは、タンパクに付きまとう変性の問題が無いため、よりシンプルに問題にアプローチできる。そこで、最近、ペプチドアレイも非常に活発に報告されている。これに関しても、追ってご紹介していく。
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