遺伝子傷害検出抗体

Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody (Clone# NO₂G52)

抗ニトログアノシンモノクローナル抗体 (Clone# NO₂G52)

Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody

抗ニトログアノシンポリクローナル抗体

8-Nitroguanine(lyophilized)

8-ニトログアニン（凍結乾燥品）

＜特長＞

･ 遺伝子傷害のマーカー

･ 高い特異性、免疫組織染色、ELISAで使用可能

･ モノクローナル抗体サブタイプ：IgG₁

　8-ニトログアノシンは、生体内で血管の弛緩を制御し血圧調節をつかさどっている一酸化窒素（NO）と、活性酸素（スーパーオキシドアニオンラジカル）によって生じる過酸化亜硝酸（パーオキシナイトライト）によってRNAがニトロ化された核酸です。生体組織が炎症を起した際には、多量のNOが産生され、多くの過酸化亜硝酸が生じグアノシンをニトロ化することが知られています。化学修飾を受けた核酸塩基は、脱プリン部位を生成し細胞分裂によって遺伝子を複製する際に、翻訳の間違いを引き起こし、本来G-Cの対であった部分が、分裂と共にT-A対に置き換えられた遺伝子変異を引き起こすと言われており、癌組織中にはT‐A配列が多く存在することが知られております。これらのことから、8-ニトログアノシンは発癌や遺伝子変異に関与した遺伝子傷害の指標として注目されています。

8-ニトログアノシンの構造

　今回、熊本大学 赤池孝章先生らのグループと共同で抗ニトログアノシン抗体を開発致しました。赤池先生らはまず、ポリクローナル抗体を用いて、インフルエンザ感染マウスの肺上皮細胞の炎症を起した場所でニトログアノシンが多量に生成していることを発見しました。ニトログアノシンの局在は抗iNOS抗体で染色したiNOS発現部位と一致し、過剰に産生したNOによってニトログアノシンが生成していることが示唆されました¹⁾。NOがウィルス遺伝子の変異をもたらすことは知られており²⁾、ニトログアノシンがNO由来の遺伝子変異に関与していることが考えられます。その後、力価の高いモノクローナル抗体で検討を進めていくと、ニトログアノシンは炎症部位以外にも正常な細胞でも微量ながら生体内に広く存在し、遺伝子傷害の指標としてだけではなく、生体内での酸化還元に関与し、生体機能を調節する因子として作用していることが示唆されました。抗ニトログアノシン抗体を用いれば、細胞内、特にヌクレオチドプールやRNA中にあるニトログアノシンの存在を免疫組織化学的染色によって検出することができ、ニトログアノシンの役割や遺伝子傷害や発癌機構の解明に役立つものと期待されています。

Anti-Nitroguanosine monoclonal antibody (Clone# NO₂G52)

　モノクローナル抗体は、8-ニトログアノシンとその塩基である8-ニトログアニンに強く反応しますが、正常なヌクレオシドや核酸塩基には反応しません。また酸化ストレスのマーカーである8-ヒドロキシグアニン、8-ヒドロキシデオキシグアノシン、3-ニトロチロシンとも交差しない上、構造的に8-ニトログアニンと類似しているキサンチンや2-ニトロイミダゾールとも交差しないなど、抜群の特異性と高力価を有しています。

　下図はプレートに固相化した8-ニトログアノシン結合BSA（NO₂-Guo-BSA）と各種の物質に対する、本抗体の反応を競合法ELISAで検定したものです。8-ニトログアノシンと8-ニトログアニンに対してのみ、競合物質の濃度に依存した右下がりの曲線を与え、本抗体が反応していることを示しています。他のヌクレオシド等は反応しないため、競合物質の濃度に関係なく本抗体は固相化したNO₂-Guo-BSAに反応し、ほぼ一定の値を示します。

モノクローナル抗体NO₂G52の反応性

〈用途〉

･ ELISA（1 μg/ml）、免疫組織染色（10 μg/ml）

〈モノクローナル抗体NO₂G52の反応性（IC₅₀（μmol/l））〉

･ 強く反応する(10 μmol/l)

　　8-NO₂-guanosine, 8-NO₂-guanine

･ わずかに交差反応あり(>1 mmol/l)

　　8-Br-guanosine, 8-Br-guanine, 8-Cl-guanine

･ 交差反応なし

　　guanosine, guanine, 8-OH-guanine, 8-OH-

　　deoxyguanosine, xanthine, adenine, adenosine, thymine, deoxythymidine, uracil, uridine, 3-NO₂-tyrosine, 2-NO₂-imidazole, cytosine

〈動物種〉

･ マウス（BALB/c）

〈形状および保存〉

･ 凍結溶液（1 mg/ml PBS溶液、防腐剤として0.1％ProClinを含む）

･ 冷凍（解凍後は冷蔵保存）

　本抗体はわずかに8-Br-グアノシン、8-Br-グアニン、8-Cl-グアニンと交差反応を示しますが、これはグアニンの8位近傍を正確に認識する力価が高いためと考えられます。8-ニトログアノシン、8-ニトログアニンとの反応性の差は100倍以上ありますので、問題なく使用できます。

Anti-Nitroguanosine polyclonal antibody

　ポリクローナル抗体も8-ニトログアノシンと8-ニトログアニンにのみ反応し、正常なグアノシン、グアニンには反応しません。また8-ヒドロキシグアニンや、3-ニトロチロシンとも交差しません。ウサギ由来であるためマウスなどげっ歯目の組織染色に適用できます。

ポリクローナル抗体の反応性

〈用途〉

･ ELISA（5 μg/ml）免疫組織染色（10 μg/ml）

〈ポリクローナル抗体の反応性(IC₅₀(μmol/l))〉

･ 強く反応する(1 μmol/l)

　　8-NO₂-guanosine, 8- NO₂-guanine

･ 交差反応なし

　　guanosine, guanine, 8-OH-guanine, 3- NO₂-tyrosine

〈動物種〉

･ ウサギ（日本白色種）

〈形状および保存〉

･ 凍結溶液（200 μg/ml PBS溶液、防腐剤として0.1％ProClinを含む）

･ 冷凍（解凍後は冷蔵保存）

Fig.1 インフルエンザウィルス感染マウスの肺上皮組織切片を8-ニトログアノシンポリクローナル抗体と蛍光(Vector Red)標識抗マウス抗体によって免疫組織染色した画像。

（熊本大学医学部微生物学教室　赤池孝章助教授ご提供）

Fig.2 インフルエンザウィルス感染マウスの肺上皮組織における8-ニトログアノシンポリクローナル抗体による免疫組織染色画像。

左から感染後0, 6, 8, 10日目。

8-NitroGuo (-)　　　　8-NitroGuo (+)

Fig.3 インフルエンザウィルス感染マウスの肺上皮組織。左は8-ニトログアノシンポリクローナル抗体による免疫組織染色画像。右は染色時にニトログアノシンを添加した吸収試験画像。

8-Nitroguanine(lyophilized)

　8-Nitroguanine(lyophilized)は組織染色での吸収試験用です。PBS溶液を凍結乾燥したもので、0.4 mlの超純水を加えることにより1.2 mmol/lの濃度に調整できます。予め過剰の8-ニトログアニンで処理した抗体を添加した染色像が陰性であれば、抗体による陽性像は非特異的染色ではなく8-ニトログアノシンまたは8-ニトログアニンを検出していることを意味します。

8-Nitroguanineの構造

参考文献

1) T. Akaike, S. Okamoto, T. Sawa, J. Yoshitake, F. Tamura, K. Ichimori, K. Miyazaki, K. Sasamoto, and H. Maeda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100 (2), 685 (2003).

2) T. Akaike, S. Fujii, A. Kato, J. Yoshitake, Y. Miyamoto, T. Sawa, S. Okamoto, M. Suga, M. Asakawa, Y. Nagai, and H. Maeda, FASEB J., 14, 1447 (2000).