九州大学工学研究院応用化学部門
片 山 佳 樹
前回、ゲノム上の特定の1塩基多型（SNP）のタイピング法と して蛍光検出を用いる手法をご紹介した。今回は、検出法として マススペクトルを用いるSNPタイピング法についてまとめてみ た。マススペクトルは、ご承知の通り測定対象分子の質量を計測 するものである。したがって、蛍光検出に比べ測定結果が明確で 擬陽性や擬陰性が出にくいという利点がある。また、蛍光基やハ プテンなどの標識を必要とせず、計測時間も短い（数秒から数分） ことも大きな利点である。特に、Matrix Assisted Laser Desorption Ionization(MALDI)法は、試料と混合して結晶化させたマト リックスにレーザー光を照射して、マトリックスが光のエネル ギーを吸収することに基づき試料をイオン化する手法であり、飛 行時間型（TOF）質量計測計と組み合わせたMALDI-TOFMSの 実用化により、巨大生体分子への適用が可能となり、生化学分野 への応用が飛躍的に発展した。DNAなどの核酸の場合、イオン化 に伴う断片化が顕著で、マススペクトルの利用には問題があった が、マトリックスとして3-ヒドロキシピコリン酸などが開発され、 低エネルギーでのイオン化も可能となったことから断片化の抑制 が可能となり、近年、マススペクトル分析の核酸への応用が急速 に広がっている1）。一方で、質量分析では計測対象の精製が必要な 場合が多く、塩の影響などが計測を困難にする場合がある。
マススペクトルを用いるSNPの検出法は、大きく分けて次の4 つのタイプに分けられる。このうち、最も活発に実用化が検討さ れているのはプライマ−伸長法である。
1) アレル特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーション
2) プライマー伸長法：SNP部位、あるいはそれより1塩基上流 までのプライマーを結合させておいて、SNP特異的におこる 伸長反応の生成物から判断。
3) PCRが不要な手法（Invader法）
4) その他の方法
前回述べたように、SNP部分を含む領域をPCR増幅し、アレ ル特異的なプローブをハイブリダイズさせると、標的配列に対しフ ルマッチの配列を有するプローブが安定な2本鎖を形成する。この プローブを何らかの方法で精製して質量分析するとSNPタイピン グが可能である。精製には、プローブを含む2本鎖を基板やビーズ などの担体に何らかの方法で固定し洗浄するのが便利である。実 際、DNAアレイを利用してこの種の方法が検討されている 2）。しかし、蛍光検出と同じくこの戦略では、多くのSNPを同時に計測 できる利点があるものの、プローブの設計や計測条件の設定が極め て困難である。近年、DNAプローブのかわりにPNAを用いる手 法が提案されている。PNAでは断片化が起こらないため、マトリッ クスとして2,5-DHBなどのより使いやすいものが利用でき、低塩 濃度でもハイブリダイゼーションの選択性、安定性が優れ、塩の影 響もないため、DNAプローブを用いるよりも優れている。一般的 な手法としては、ビオチン付加型プライマーを用いてPCR増幅 し、ストレプトアビジン修飾磁性ビーズに結合後、1本鎖とし、プ ローブを反応して未反応プローブを洗浄除去、その後、ビーズに2 本鎖として結合していたプローブを質量分析する(Fig.1a) 3）。この手の精製法は、VNTRやSTRなどの特定塩基配列が繰り返すタン デムリピート型の多型分析でも用いられている4,5） 。さらに、多くのSNPの同時計測を可能にするため、プローブに8-アミノ-3,6- ジオキサオクタン酸を1個から複数個PNAプローブ合成時に付加 しておき、プローブ間の質量差を増幅する手法も報告されている (Fig.1b)6）。しかしながら、プローブ間のハイブリダイゼーション 能力に大きな差がないため、上記の手法でも一方のアレルの計測で も別アレルの生成物のシグナルも検出され、ASO法自体の欠点は 以然として存在し、擬陽性を出さないという質量分析の長所を活か しきれていない。
利用するSNPタイピング
プライマー伸長法は、ポリメラーゼなどの配列特異性の高い酵 素反応を用いるため、ASOを利用する手法に比べ識別能が高く、 近年,マススペクトルとの併用で多くの報告例がある。
いずれも、対象とするSNP部位の1塩基上流までの配列に相補的 なプローブをハイブリダイズさせ、その後、DNAポリメラ−ゼで 鎖を伸長させ、アレル間での伸長生成物の質量差を計測する。ポ イントは如何に質量差を拡大できるかと、計測対象伸長生成物の 長さ（質量）を如何に小さくできるか（質量分析時の断片化を抑 え、かつ質量差を相対的に拡大する）である。
PINPOINT assayは、プライマー伸長反応時に4種類の塩基に対応するジデオキシヌクレオチド3リン酸(ddNTP)を添加する方 法である7,8）。この場合、伸長反応はいずれの塩基の場合でも1塩 基で停止する(Fig.2a)。従って、プライマーに1塩基が付加した 生成物間の質量差を計測することになる。この手法は、プライマー 伸長法の質量分析への適用法として最初の実用的手法であり、蛍 光や放射性同位体などの高価な標識を必要とせず、質量分析の利 点を利用できる。しかし、1塩基間の質量差はそれほど大きくな く、例えば頻度の多いA/T多型では、アデニンとチミンの間の分 子量の差は9しかなく、ヘテロ対合などの場合、検出できないこ とも多い9）。ナトリウム塩やカリウム塩が混在すると、これらのカ チオンとの付加物が生じ、計測をより困難なものにする。この様 な欠点を補うため、できるだけ計測対象の分子量を小さくする工 夫としてプライマーに切断サイトを導入しておき、伸長反応後に 切断して計測対象をできるだけ小さくする手法10） や、1塩基間の質量差を拡大するため、例えばDNA配列分析でダイターミネ− ターとして用いられるフルオレセインやCy5などが標識された ddNTPを利用して伸長反応を行う手法などが報告されている 9）。たとえば、A/Gアレルを判定する場合、ddGTPとフルオレセイ ン‐12‐ddATPを用いた場合、両アレルでの生成物の分子量差は 508Daと大きくなる。PINPOINT assayは、生成物の分子量が小さいため、複数のSNPを一度に計測する場合、分子量の重なり を避けやすいため、多くのSNPを一度に検定する性能に優れてい る。現在のところ、12種類のSNPをジェノタイピングした例が ある8）。
PINPOINT assayの改良のため、マスタグをddNTPに標識したり、プライマー切断反応を利用するのは手間とコストを要する。 これに対し、伸長反応時に一種類のddNTPと残り3種類のdNTP を用いるのがPROBE法である11）。この場合では、SNP部位に ddNTPと相補的な塩基がある場合は1塩基で伸長反応が停止する が、異なる塩基の場合は、次に鋳型鎖にddNTPと相補的な塩基が 現れるまで伸長反応が継続する(Fig.2b)。そのため、アレル間で 伸長生成物の分子量鎖は1〜10塩基分程度にもなるので、質量差 が大きくなり、判定が容易になる。最近、PROBE法をチップ上 で行い、実用性を向上させた手法も報告されている 12）。この場合、2 cm角のシリコンチップ上に各々2.5 mm角の6×6のアレイ状に1 ml(1.56 pmol)のDNAを固定化している。固定化法は、3-アミノプロピルトリエトキシシランでシリコン表面を修飾してア ミノ基を導入し、N-Succinimidyl(4-Iodoacetyl)aminobenzoate (SIAB) で処理してチオール反応性基を導入し、5'‐チオール化プ ライマーで増幅したSNP部位を含む領域を結合する(Fig.3)。本 手法は、伸長生成物の精製が容易で、実用性の高い手法として興 味深い。
PROBE法は、伸長生成物間の分子量差を拡大するよい手法で あるが、一方のアレルでは複数塩基伸長が起こるので、多くの SNPの一斉計測では別のSNPサイトの生成物との分子量が接近 する恐れがある。また、長い生成物の場合、検出されない恐れも 出てくる。例えば、19 merのプライマーを用いた場合、10塩基伸長した生成物のマスシグナル強度は、1塩基伸長生成物に比べ1 ／7になってしまう。これを改善した手法がVSET法である 13）。この場合は、伸長反応に1種類のdNTPと残り3種類のddNTP を用いる。VSET法では、一方のアレル（SNPサイトがddNTP のどれかと相補的）では1塩基の伸長が起き、dNTPと相補的な サイトでは、その次まで（2塩基）伸長が起こる(Fig.2c)。従って、 PINPOINT法に比べ検出感度は格段によいため、シビアな脱塩な どが必要なくなる一方で、PROBE法の欠点も克服できることに なる。
プライマー伸長法では、伸長生成物の方を検出するのが普通で あるが、Survivor assayでは、系中に加えた4種類のddNTPの残量を計測する(Fig.4) 14）。計測にはESI-MSを用いる。ESI(electrosplay ionization)は、小分子の定量的測定が高感度で行える利点がある。サーマルサイクラーでの反応（20〜30サイ クル必要）において、伸長したプライマーが未伸長プライマーと 競争しないようにプライマーは大過剰用いる必要があり、加える ddNTPの量の最適化が重要な因子となる。コントロールとテスト サンプル間でのマスシグナルのピーク面積比が40％以上であると き優位な差があるといえる。この手法は、同じ4種類の化合物 (ddNTP)を測定するだけで、どんなSNPも計測でき、プログラ ムやデータ処理が容易かつ迅速である利点があるが、一方で、複 数のSNPを同時に計測するのは不可能である。
GOOD assayは、プライマー伸長反応後、生成物を小さな分子量の部分まで消化することと、生成物の荷電を＋1あるいは−1に することの双方により、検出感度と判定精度を向上することを特 徴とする手法である(Fig.5)15）。DNAのMALDI-TOF MS分析では、DNAを総荷電＋1あるいは−1にすると検出感度が100倍 向上するため、単一チューブ内で反応するだけで生成物を精製す ることなく計測できる。計測手法としては、ポジティブモードと ネガティブモードがある。ポジティブモードでは、プライマーの 3'末端にホスホロチオエート結合を介した塩基を3つ導入し、そ の中間の塩基にはトリメチルアンモニウムヘキシル基を導入して おく16）。このプライマーを用いて伸長反応を行うが、液中には α-S-dNTPとα-S-ddNTPを加えておく。したがって、伸長生成物 では、プライマーの3'-末端側はすべてホスホロチオエート結合と なる。その後、ヨウ化メチルで処理すると、ホスホロチオエート 部分はメチル化されアニオン荷電が消失する。これを5ﾕ-ホスホジ エステラーゼ処理すると、通常のリン酸エステル結合を有する塩 基部分は消化され、メチル化されて中性となったホスホロチオ エート部分のみが残ることになる。これを質量分析することで、高 感度にSNPが判定できる。ネガティブモードでは、プライマーの 3’末端にホスホロチオエート結合を介した塩基を1つ導入し、さ らにその先に通常のリン酸エステル結合で塩基を1つ導入する。 これを用いてポジティブモードと同様の条件で伸長反応、メチル 化処理、ホスホジエステラーゼ処理を行うと、メチル化したホス ホロチオエート結合の中に1つだけリン酸エステル結合（−1価 アニオン）が残った生成物が得られるのでこれを計測する。
本手法は、通常のDNAを分析するものではないので、断片化が 抑制されるため、マトリックスも自由に効果的なものを選択でき る。精製が必要ない点、感度がよい点など魅力的な手法であるが、 修飾α-S-dNTPが必要な点、伸長反応後のステップが長い点が欠 点である。
これまでの手法はいずれも、SNPを含む領域をPCR反応によ り増幅する必要があった。PCRは、ハイスループット化の大きな 障害となるため、これを必要としない手法があれば魅力的である。 前回ご紹介したようにInvader assayは、レポータープローブとInvasiveプローブを用いるPCRが不要の手法である。すなわち、 フラップエンドヌクレアーゼを用いてレポータ−プローブの一部 を切断し、これをFRETプローブに挿入して再度切断反応を行う ことでFRETを解除し、蛍光変化からSNPを判定する手法であ る。ここで、もしFRETプローブの切断される部分がマススペク トル分析で検出可能であれば、本手法を質量分析に応用できる。具 体的には、レポータープローブのフラップ部分（酵素で切断され る部分）をアレルの違いにより、一方のプローブでは3'末端にチ ミンが2つ、もう一方のアレルでは3つ存在させ、これが第2の プローブにハイブリダイズすると、前者では3'−ビオチン化T T Tが、後者では3'−ビオチン化T T T Tが切断されるように設計されている(Fig.6)17） 。これをストレプトアビジン修飾磁性ビーズで捕集し質量分析に供する。オリゴチミジンは、DNA配列として は質量分析時における断片化が最も起こりにくく、検出感度もよ い。マトリックスとしてもα-CHCAなど、通常のDNA分析では 使えないものも使用可能である。この手法を用いると、第1、第2 ステップの反応それぞれ2時間を費やして1 μg（0.5 amol）のDNAから720 fmolのシグナル分子が得られ、質量分析で計測可能である。現在のところ、12種類のSNPを同時計測可能である ことが示されている。この手法では、切断されなかった過剰のビ オチン化プローブも捕集されてしまうはずであるが、この様な長 いプローブは検出条件では気化されず妨害とはならないという。
このほかには、多型部分を含むPCR産物を利用する手法とし て、これをペプチド産物に変換して質量分析する手法がある 18）。プライマーとしてポリメラ−ゼ結合サイトと翻訳開始サイトを組み 込んだものを用い、増幅産物をin vitro翻訳して得られるペプチドを質量分析で判定する。DNA配列のままではPCR産物のアレル 間の質量差は極めて小さく検出不可能であるが、ペプチドにすれ ば質量分析自体の感度も上がると同時に全体の長さも短く（質量 が小さく）なり、しかもアミノ酸の変化に変換されるためアレル 間の質量差も拡大する。SNPではないが1塩基挿入変異などの検 出に用いられた例がある。また、安定同位体標識dNTPを用いた 配列分析を利用する手法もあるが19）、これらの手法はむしろSNP マッピングに向いているといえる。
以上、質量分析を用いるSNP判定法について最近の動向をまと めてみた。マススペクトルを用いる手法は、検出結果が明確で蛍 光検出のようなあいまいさが避けられる。また、検出速度にも優 れ、自動化が容易という利点がある。反面、生成物の精製が重要 になること、複数のSNPの同時計測能力がそれほど高くないこと などの欠点もある。しかしながらプライマー伸長法との組み合わ せは今後有効な手法であることは間違いないであろう。
SNPタイピングは、今後ゲノムワイドで行うとすると、実用性 を考えた場合、スループットで現状の手法の1〜2桁、コストで少 なくとも10分の1になる必要がある20）。当初活躍したASOを用 いるハイブリダイゼーション法は、多くのSNPを同時に測定する タイピングでは、条件設定が難しい。現在ではプライマー伸長法 やライゲ−ション法など酵素反応を組み合わせたものが主流にな りつつある。今後、真に実用的な手法もこのあたりから生まれる かもしれないが、現状を考えるとまったく異なる考え方も必要か もしれない。また、WAVE system21）の様なHPLC法なども、現在のナノHPLCや2次元HPLCなどの開発を考えると新手法を考 える上でのヒントとなるかもしれない。次回からは、DNAをひと まず離れ、プロテオームなど、タンパク分析の新手法について考 えてみることにする。
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