九州大学工学研究院応用化学部門
片 山 佳 樹
異なる個体間で遺伝子上の同一箇所の塩基配列が異なる場合、その頻度がその種全体の1％以上である時に、これを多型、1％以下のものを突然変異という。ある遺伝子が次世代に受け継がれる場合、その近傍にある多型部分も同時に受け継がれる場合が多いため、多型は特定の遺伝子のゲノム上での位置決定に有用なマーカーとなる。すなわち、ある疾患を有する群に特異的な変異を見つければ、その近傍に疾患遺伝子が見つかる可能性が高い。一塩基多型（SNP）は、最も頻度の高い多型（1000塩基に一つ）であり、最も有用性が高い。そのため近年、この位置を特定するマッピングにより、既に膨大なSNPデータが収集されている。しかしながら、得られたSNPを用いて診断や解析を行う場合、特定のSNPがどんな塩基になっているか（SNPのタイプ）を知る必要がある。これをSNPタイピングという。SNPタイピングでは、いかに正確かつ迅速、安価に行えるかがポイントとなる。
SNPタイピングを行う場合、以下の4つの戦略が用いられる。
1) アレル特異的なオリゴプローブを用いるハイブリダイゼーション
2) プライマー伸長法：SNP部位、あるいはそれより1塩基上流までのプライマーを結合させておいて、SNP特異的におこる伸長反応の生成物から判断。
3) kinetic PCR ：特定のSNP特異的なPCRを利用し、増幅過程を追跡する。
4) PCRが不要な手法
検出には、蛍光法とマススペクトルが利用される。特に最近、 プライマー伸長法とマススペクトルを組み合わせたものが非常に多く報告されているため、これに関しては、次回改めてご紹介することにし、今回は蛍光法を利用したSNPタイピングを概説する。
SNPを見分ける手法として最も単純に思いつくのは、通常のDNAマイクロアレイの手法を利用してSNP部位を含むオリゴDNAプローブでアレル特異的な2本鎖形成反応を介してジェノタイピングする手法である1,2)。この手法は、最も早くから検討された手法であるが、固定化プローブのG/C含量や熱力学的パラメータなどを同程度にし、しかもクロスハイブリダイゼーションを避けられるようにする必要があるなどのため、ハイブリダイゼーションの条件の最適化が難しく、同時に多くのコントロールを必要とするなど、実用的観点からは多くの問題を含んでいる。
プライマー伸長法は、ポリメラーゼなどの配列特異性の高い酵素反応を用いるため、ASOを利用する手法に比べ識別能が高く、近年、マススペクトルとの併用で多くの報告例がある。蛍光法を組み合わせた手法に関する報告はそれほど多くは無いが、幾つかの優れた手法が報告されている。それらは手法上から、均一系で行うものと、基板や担体上で行うものに分類できる。
プライマー伸長によるアレル特異的産物の生成を均一系で蛍光検出するには、プライマー伸長に伴い、蛍光シグナルが変化する仕組みが必要である。その様な例として、蛍光エネルギー移動（FRET）を利用するTDI assayがある(Fig.1a) 3)。これは、SNP部位の1塩基上流までの配列に相補的なフルオレセイン標識プライマーを用い、これに対し、それぞれ異なる蛍光基（ROXとTAMRA）で標識したジデオキシヌクレオチド3リン酸(ddNTP)を用いてプライマー伸長反応を行う。ジデオキシ体であるので、伸長は一塩基で止まるが、この時組み込まれた塩基に標識されている蛍光基へフルオレセインからFRETが生じてフルオレセインの蛍光が減弱するとともに、対応する塩基に標識された蛍光基のシグナルが増大する。これを計測すればジェノタイピングができるというものである。この手法は、 条件の最適化などが簡単である半面、同一チューブ内で全ての操作ができるようにするため、PCR後、過剰のプライマーやdNTPを酵素消化し、その後、その酵素を熱失活するなど、多段階の操作が必要で、煩雑さを伴う。純粋なプライマー伸長法では無いが、これを改良した手法にDOL assayがある（Fig.1b） 4)。この手法では、ポリメラーゼによる塩基伸長の代わりに、2つのオリゴヌクレオチドをDNAリガーゼで結合することを利用する。すなわち、5ﾕ末端にフルオレセイン標識したSNP部位の一塩基上流までの配列に相補的なオリゴプローブと、3ﾕ末端に蛍光標識し、SNP部位を含み、それより下流の配列に相補的なオリゴプローブを用意する。後者は、SNP部位の相補塩基の違いにより、標識する蛍光基をROXとTAMRAと言う風に変えておく。これらのプローブとDNAリガーゼをPCR反応溶液に同時に加えておくと、SNP部位を含むPCR産物の増幅に伴い、リガーゼにより結合したプローブが生成してくる。その際、結合されるプローブはSNP部位に相補的なものに限られるから、フルオレセインの励起波長で励起すると、FRETの結果増加する蛍光波長がいずれのものであるかによりSNPが判定できる。DOL assayでは、全ての反応が1つのチューブ内で一度に行え、非常に簡単であるが、多検体処理には向かない欠点もある。
蛍光検出の場合、プライマー伸長を基板上で行うと、蛍光標識の種類が最低1種類あればよいことと、多くのコントロールが必要ないことから高密度のアレイは必要なく、さらにプライマーを合成してからアレイを作成できる利点がある。1塩基伸長を用いるものとしては、Affymetrixのオリゴヌクレオチドタグアレイを利用した方法や、Pastinenらの方法がある。
Affymetrixの手法は、従来のマイクロアレイが初めから決められた目的にしか使えないという欠点を克服するために、プローブではなく、特定の配列を認識するためのタグ配列を固定化してアレイとしたものを用いる手法である（Fig.2a） 5)。この場合、標的のSNPに対するプローブをタグに結合したプライマーを合成し、タグアレイ上に固定化し、SNP部位を含むPCR産物をテンプレートとして、蛍光標識ddNTPを用いて1塩基伸長反応を行う。この手法は、30×30 mmの基板上に32000種づつのパーフェクトマッチとミスマッチのプローブを固定できるが、タグの設計にはASOでのプローブ設計同様の最適化の困難さを伴う。これに対し、Pastinenらは表面をイソチオシアネート処理したガラスプレートに末端アミノ化オリゴDNA型プライマーを固定したプライマーアレイを調製している。これとPCR産物を2本鎖形成後、蛍光標識ddNTPで一塩基伸長すると加えた標識塩基に対応するSNPのスポットのみが蛍光を発することになる（Fig.2b） 6)。彼らはこの手法を一塩基伸長だけではなく、さらに多くの塩基配列を伸長させる手法にも応用している（Fig.2c） 7)。この場合には、PCR産物からT7RNAポリメラーゼでRNAとして2000倍程度増幅し、プライマーアレイと逆転写酵素によって伸長反応を行う。そうすることで、PCRの際に、1％程度なら複数の副産物が生成しても影響が無いようにしている。この手法では、PCRに4時間、検出までに1時間、検出に10分という時間で、40の変異に対し8000以上のジェノタイピングが可能であるという。
基板ではなく、蛍光ビーズ担体上にプライマー伸長産物を捕捉し、フローサイトメトリー分析を用いることで多検体処理を可能にした方法としてLuminex assayがある（Fig.2d） 8,9)。この手法では、各プライマーは、5'端にそれぞれ異なるZipCodeと呼ばれる配列を付加してある。このプライマーを用いてSNP部位を含むPCR産物をテンプレートとして、蛍光標識ddNTPを用いて一塩基伸長反応を行う。こうして得られる蛍光性伸長産物を蛍光性ビーズで捕捉するが、各ビーズ表面には、それぞれ別のZipCodeと相補的なcZipCode配列が修飾してあるため、ビーズごとに同種のプライマーを捕捉する。その後、ビーズの蛍光と伸長した塩基にし標識された蛍光の種類をセルソーターで分析して55種類のSNPに関し181のジェノタイピングを一度に行っている。最近では、異なる波長の蛍光ビーズを多く用いることにより、さらに多検体の処理も可能であるとされている。
Kinetic PCRは、PCR産物の生成過程を蛍光法などでモニターする手法である。この時、PCR産物がアレル特異的に生成すれば、SNPタイピングに利用できる。TaqManPCR法は、代表的なKinetic PCRの手法である(Fig.3a) 10-12)。この場合、SNP部位を含む配列に相補的なPCRプライマーと分子内にFRETを起こす２種類の蛍光基を標識し、２つのPCRプライマーにはさまれた領域のどこかに相補的なプローブを用いる。ここで用いるTaqDNAポリメラーゼは、5'→3'エンドヌクレアーゼ活性を持っているので、テンプレート上に相補鎖が合成されていく過程で、その途中に結合している蛍光オリゴプローブは分解される。そのため、2種の標識蛍光基間のFRETが解消され、蛍光波長が変化する。両者の蛍光波長の強度変化をリアルタイムにモニタリングすることでPCR産物の生成過程が追跡できる。PCRは、用いるプライマーが結合できるアレルでのみ起こるから、PCR産物生成からSNPの判定ができる。同様にFRETを利用するものに、分子ビーコンを用いる手法がある（Fig.3b） 13,14)。分子ビーコンは両末端に蛍光基と消光基を標識した一本鎖DNAで、分子内で相補的配列を有し2本鎖を形成すると、2つの色素が近接して蛍光が消光する。しかし、中央の配列に相補的な配列にハイブリダイズすると、2つの色素間距離の増大に伴って蛍光が回復する。そこで、SNP部位の塩基と、それに対応して標識された蛍光基がそれぞれ異なる４種の分子ビーコンを用いると、標的部位のPCRによる増幅に伴って回復する蛍光波長を測定することでSNPタイピングが均一系で可能となる。この手法は、スマートな方法であるが、PCR増幅条件が難しく、ゲノムDNAで実際に行うと条件設定に難がある。分子ビーコンは、これとは別に後述するSniper assayで威力を発揮する。
TaqMan PCR法と同じアレル特異的PCR反応を利用し、蛍光ではなく、PCR反応の進行に伴いdNTPが消費される際に生成する副産物であるピロリン酸を、アデノシン5'-ホスホサルフェートとATPスルフリラーゼを用いてATPに変換して化学発光分析するPyrosequncingも報告されているが、実用性の程は定かでは無い15)。また、各アレルに対応するPCRプライマーをアダマンタンやDANSYL等の異なるハプテンで修飾し、これを用いてPCRを行い、抗体標識ビーズでPCR産物を捕捉して、酵素標識抗体で検出するLCx assay等も報告されている。単純にアレル特異的PCRを行って、生成する2本鎖DNAの増加を2本鎖特異的蛍光プローブであるPicoGreenで追跡する簡易法も報告例がある16)。
アレル特異的Kinetic PCR法は簡便さが長所であるが、プライマーの結合が完全にアレル特異的とはならないため、別のアレルでも遅いながらPCRが進行する等、条件設定と正確性に難がある。また、多検体処理に適さない。
PCRは、サンプル量が限られるゲノムDNAを用いてSNP判定をする際に、シグナルを増幅するために非常に有効であるが、副生成物が生じる危険性と共に、時間がかかると言う欠点がある。もし、PCRを用いることなくシグナルが増幅できれば、非常に操作性のよい多検体処理に適した手法が開発できると考えられる。その様な可能性を有する手法としてInvader assayとSniper assayがある。
Invader assayは、2つのアレルに特異的なレポータープローブ、InvasiveプローブとFlapエンドヌクレアーゼによる切断反応を利用する手法である（Fig.4a）
17-19)。レポータープローブは、テンプレートDNAに対しSNP部位から3'末端側に相補的な配列を有し、さらにプローブの5'側にフラップと呼ばれる配列が存在する。Invasiveプローブは、テンプレートのSNP部位に対し5'側に相補的な配列を有し、SNP部位にあたる部分の塩基は任意のものでよい。この2つのプローブをテンプレートDNAと混ぜて2本鎖形成反応を行うと、レポータープローブとテンプレートで形成される2本鎖のSNP部位にInvasiveプローブが一塩基侵入することになる。Flapエンドヌクレアーゼは、この構造を認識してレポータープローブの2本鎖を形成していないフラップ配列部分を切断する。溶液内には、Fig.4aの様に2種のレポータープローブのフラップ配列に相補的な一本鎖部分を有するFRETプローブが入っており、切断されたフラップは相当するFRETプローブに結合する。FRETプローブは、その他は分子内で2本鎖を形成する構造をもち、蛍光基と消光基で標識されており、分子内で消光している。ところが、フラップが結合すると、ここに先ほどと同様の構造が生じ、蛍光基を標識した一本鎖部分が切断され、FRETが解除されて蛍光が増大する。増大する蛍光波長から、どちらのアレルであるかが判定できるわけである。ただし、フラップ部位は切断されなくてもFRETプローブに結合する可能性があるため、弱いながら切断反応は進行する。したがって、2種の蛍光増大のタイムコースを追跡して、その差からアレルを判定する。この手法では、蛍光標識プローブは共通のものを使用でき、また一定温度で行え、PCRも不要であることからコストが抑えられる利点がある。ただし、サンプルDNAが他の手法に比べ大量に必要となる欠点もある。
PCR不要の手法として、前述の分子ビーコンを用いるSniper assayと言う手法も報告されている(Fig.4b)
20,21)。この手法では、両端にサンプルSNP部位を含む領域に相補的な配列を含み、一方の末端1塩基が各アレルのSNP部位に相当するように設計した一本鎖プローブを用いる。このプローブとテンプレートDNAをハイブリダイズすると、SNP部位が相補的であったプローブのみがリガーゼで環状DNAに変換される。プローブの残りの部分には、分子ビーコンと相補的な配列が組み込まれており、環状になったものはここで用いる特殊なポリメラーゼにより連続して相補鎖が合成され、次々に分子ビーコンが結合するため、蛍光が大きく変化する。この手法は、迅速にジェノタイピングできる可能性を有している。
以上、蛍光を用いるSNP判定法を述べた。どの手法にも一長一短はあるが、今後、多検体処理の面から考えると、Pastinenらのアレイ法やLuminex assay、迅速性からはDOL assay、Invader assay、Sniper assayなどが有望である。ただし、いずれの手法も、より少量のサンプルで行えるようにすることや、S/N比をあげる、自動化の工夫など、今後更に改良が必要であろう。
次回はマススペクトルを用いるSNPタイピングについてご紹介する。
参考文献
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| 氏 名 | 片山佳樹（Yoshiki Katayama） 41歳 |
| 所属 | 九州大学工学研究院応用化学部門・応化分子教室 |
| 連絡先
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〒812-8581 福岡市東区箱崎6-10-1
TEL：092-642-3608 FAX：092-642-3611 |
| 出身学校 | 九州大学工学研究院合成化学専攻 学位：工学博士 |
| 細胞情報と化学情報を相互変換する分子の創製と機能
（科技団さきがけ） 各種細胞シグナル伝達計測系の開発 ポストゲノムを指向したタンパク間相互作用や 細胞表現系ハイスループットアッセイ系の開発 |
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| 主な著書 | NO放出薬の臨床応用の可能性、循環器科、44(4)、344(1998)
ケージド化合物、蛋白質、核酸、酵素、43(12)、397(1998) |
| 趣味 | ドライブ、イラスト |
