毒から薬へ：イモ貝毒コノトキシンの研究
(From Venoms to Drugs: Studies on conotoxin from cone snail venom)

[ Summary ]

Conotoxins are peptide toxins isolated from the venom of marine cone snails. They are typically small disulfide-rich peptides containing 11-30 amino acid residues. Because conotoxins are highly specific for ion channels and neurotransmitter receptors, they are widely used as research tools in neuroscience and also considered as promising therapeutic agents. In this review article, structure-activity relationships of several conotoxins such as μ-, ω-, and λ-conotoxins are described. Active site of μ-conotoxin GIIIA specific for muscle sodium channels was Arg13 and that of ω-conotoxin GVIA specific for neuronal N-type calcium channels was Tyr13. λ-Conotoxins are a group of conotoxins with novel disulfide pattern and this unique pattern is essential for their biological activity..

キーワード：
生物毒、イモ貝、コノトキシン、イオンチャネル、構造活性相関、SS架橋、鎮痛薬

１．はじめに

　本号はドージンニュースの記念すべき第100号である。実は筆者 がこのニュースに総説を寄稿するのはこれが初めてではない。ちょ うど4半世紀前1976年11月発行の第3号に「ペプチド合成試薬 とその応用」と題して恩師である泉屋信夫先生（九州大学理学部） と共同執筆させていただいた。当時大学院生であった筆者は液相法 によるペプチド合成に明け暮れていたように思う。Merrifieldらに より固相合成法が開発されてからすでに10年以上経っていたが、 まだ世の中は液相法が主流であり、「何を合成するか」と同時に「ど うやって合成するか」が大きな問題であった。あれから25年、自 動合成機やHPLCの普及により、ペプチドは誰でも比較的容易に合 成できるようになった。外注専門の業者も多く誕生した。こうした 中で筆者が研究対象として選んだのがペプチド毒である。ペプチド 毒の多くが分子内に複数のSS結合を有し、合成化学的に「玄人向 け」と考えたことは事実であるが、同時に「脳の世紀」と言われる 21世紀に神経系に作用するペプチド毒の研究が役に立つと考えたか らである。

２．コノトキシンとは

　"From Venoms to Drugs"と題する国際会議が1998年にオーストラリアで開かれた。2002年には第2回目が開催される予定で ある。Venomとは毒腺の発達した生物の毒液のことである。自然 界には毒を用いて獲物を補食する生物が多く棲息し、これらの生 物毒は極微量で効果を表し、その作用部位も限定されていること から、上手く利用すれば新しい薬としての応用が期待される。 　イモ貝は熱帯から亜熱帯の海に棲息し、毒矢を用いて魚や貝な どを捕食する肉食性の巻き貝である。
イモ貝の毒腺に含まれる活 性成分の多くはペプチドであり、これらは一般にコノトキシンと 呼ばれている^1、2）。コノトキシンはイオンチャネルに結合してその 機能を特異的に阻害することから、神経科学の分野では研究に有 用な薬物として広く利用されている。一方でモルヒネに替わる強 力な鎮痛薬として実用間近なものもあり、新しい医薬品のリード 化合物としても注目されている。本稿では筆者の研究成果を中心 にコノトキシン研究の現状を紹介する。

３．コノトキシンの作用部位

　コノトキシン研究をリードしてきたのはOlivera（ユタ大学）の グループである³⁾。彼らにより完全なアミノ酸配列が決められた最 初のコノトキシンがα-コノトキシンGIである。筆者がかつて所属 していた三菱化学生命科学研究所でも1980年代に沖縄産のイモ貝 を用いてスクリーニングを開始し、μ-コノトキシンのアミノ酸配列 を決定した。薬理学的な解析から神経筋接合部において、 α-コノトキシンはアセチルコリン受容体をブロックし、μ -コノトキシンは筋肉のNa⁺チャネルを阻害することが明らかとなった。どちらも結果 的に筋肉の収縮阻害をおこし、この時点でコノトキシンの致死毒性 の本体について一応の回答が得られた（Fig. 1）。

　その後Oliveraらは、イモ貝毒のフラクションを直接マウスの脳 室内に注入することにより、摘出筋標本を使った従来のアッセイ法 では見つからなかった多くのペプチドを単離した。震えを起こす "shaker peptide"は神経伝達物質の放出に関わるN型Ca²⁺ チャネルを阻害することが明らかとなり、ω-コノトキシンとして知られる このペプチドは神経科学の研究試薬として広く使用されるのみなら ず、強力な鎮痛剤としてアメリカで認可される見込みである。最近 では筋肉に興奮性硬直をもたらす物質としてNa⁺ チャネルの不活性化阻害剤d-コノトキシン及びK⁺ チャネル阻害剤κ-コノトキシンが単離されている。この他にも作用部位の特定されない多くの活性ペ プチドが発見されており、イモ貝毒はさながら薬物の宝庫である

4．イオンチャネル

５．コノトキシンの分類

　Fig. 2に代表的なコノトキシンのアミノ酸配列をまとめた。最 初のギリシャ文字は作用部位を表す。μ筋肉のNa⁺ チャネル、ωは電位依存性Ca²⁺チャネル、αはアセチルコリン受容体に作用す ることを意味し、これらに最近δ（Na⁺チャネルの不活性化阻害） やκ（K⁺チャネル阻害）が加わった。次のアルファベットはイモ 貝の種類を表しているが、一文字の場合は魚食性のイモ貝、二文 字の場合は貝食性あるいは虫食性のイモ貝を表す。例えば、Gは C. geographus由来、MはC. magus由来、そしてTxは貝食性のC. textile由来である。アルファベットの次のギリシャ数字は化 学構造（システインの配置）の分類を表し、最後のアルファベッ トは同一グループの中の固有種の符号である。

6．μ-コノトキシン

　筆者らが最初に構造活性相関の対象としたのがμ-コノトキシン である。その理由はμ-コノトキシンのアミノ酸配列が筆者の共同 研究者により決定されたからである⁴⁾。22残基の配列中6残基が Cysであり、ArgとLysを多く含む強塩基性のペプチドである。

　結合阻害実験によりμ-コノトキシンはNa⁺ チャネル上でフグ毒テトロドトキシンと同じ部位に結合することが明らかにされてい るが、テトロドトキシンが神経と筋肉の両方のチャネルを阻害す るのに対し、μ-コノトキシンは筋肉のチャネルに特異的である。こ のようにμ-コノトキシンは筋肉と神経のチャネルを区別する初め ての薬物として注目された⁵⁾。

　筆者らはμ-GIIIAの活性部位を明らかにするため系統的なアミノ 酸置換アナローグの合成を行った。合成法の詳細については別に 解説しているので、そちらを参照していただきたい ⁶⁾。Fig. 3は合成したアナローグの摘出ラット横隔膜標本の電気刺激による収縮 に対する阻害効果をまとめた結果である⁷⁾。この図から、塩基性残 基の置換では活性が低下し、酸性残基の置換では活性が上昇する 傾向があることが認められる。従ってμ-GIIIAの活性には分子全体 の塩基性が重要である。中でも最も大きな活性低下が見られたの が13位のArgを置換した場合である。興味深いことに13位のArg はLysに置換しても活性が低下するのに、19位のArgはLys置 換では活性に影響が無かった。このことは13位の場合には単なる 塩基性ではなく、グアニジノ基の存在がチャネルとの結合に重要 なことを示している。

　コノトキシンのように分子内に複数のSS結合をもつペプチド の場合は環化反応（SS結合形成反応）の成否が収率を大きく左右 する。一連のアナローグ合成の過程で、活性中心のArgを置換し た場合を含め大半のアナローグでは高収率で目的物が得られたの に対し、Hypを置換した場合には環化反応で主生成物が見られず、 特に6位を置換したものは最終的に目的物が単離出来なかった。 このことはHypの環状構造が局所的な立体構造を制限し、結果的 に分子のフォールディングに影響していることを示唆している。

　NMRにより解析された結果によればμ-GIIIAは比較的平板な三 角おにぎりのような立体構造をとっており、13位のArgはその一 つの角に位置する（Fig. 4）。μ-GIIIAの場合、立体構造中で活性に重要な残基（Arg13、Lys16、Hyp17、Arg19）は分子の一方に集中し、他方に立体構造形成に重要な残基（Hyp6、Hyp7）が あることから、分子全体が活性ドメインと構造ドメインにきれい に分けられることが示唆された⁷⁾。また、13位のArgをAla置換 したアナローグと天然物の立体構造にほとんど相違が無いことか ら、活性低下は立体構造変化によるものでないことを確認した ⁸⁾。

　最近筆者らは上記の構造活性相関の結果に基づき活性部位の反 対側にある5位のThrをCysに置換し任意の蛍光プローブを導入 した誘導体を調製した⁹⁾。

7．ω-コノトキシン

　電位依存性Ca²⁺チャネルはその性質によっていくつかのサブタ イプに分類され、チャネル孔を形成するα₁サブユニットの構造も その多くが遺伝子の解析から明らかにされている。その中でN型 （α_1B）及びP/Q型（α_1A）は神経系に分布し、神経伝達物質の放出 に深くかかわっている。

　Ca²⁺チャネルを阻害する初めてのコノトキシンとして C. geographusから単離されたω-GVIAはN型のチャネルを不可逆 的に阻害する。そのアミノ酸配列は1984年Oliveraらにより報告 され¹⁰⁾、SS架橋様式は1986年榊原らにより決定された ¹¹⁾。

　筆者らはω-GVIAの活性部位を解明するため系統的なアミノ酸置換をおこなった（Fig. 5）^12、13)。その結果13位のTyrの置換が結合活性に最も大きな影響を与えた。また、この残基をPheに置 換しても活性が大きく低下することから、水酸基が活性に必須で あることが明らかになった。13位のTyrは多くのω-コノトキシ ンに保存されており、サブタイプ特異性にかかわらず、Ca ²⁺チャネルに対する共通の阻害部位であることが示唆された。Tyr13に 次いで重要なのは2位のLysであったが、この両残基は分子内で 近接して存在し、その領域がCa²⁺チャネルとの結合部位であるこ とが示唆された。

　また、一連のアナローグ合成の過程でAsn20とThr23をAla置 換するとSS結合形成が上手くいかないという現象を見つけた。 ちょうどその時期、4つのグループから相次いでNMRによる立体 構造解析の結果が発表されたが、その結果、ω-GVIAは分子内に3 本のβ-ストランドよりなる逆平行β-シート構造をもち、Asn20と Thr23の側鎖が分子内水素結合によりこのβ-シート構造を安定化 していることが示された。したがって筆者らの結果は分子内水素 結合がペプチドのフォールディングに重要であることを示す非常 に興味深い事実である。

　ω-GVIAの構造活性相関の結果もFig.4のようにまとめられる。興味深いことにμ-GIIIAの場合と同様、分子全体を活性ドメインと 構造ドメインに分けることができる。このことは、活性ドメイン 上にある残基を変えることにより全体の構造には影響することな く、チャネルに対する選択性を変えられる可能性を示唆する。

　ω-GVIAはN型チャネルに作用するがP/Q型チャネルには作用 しない。P/Q型チャネルはC. magusから単離されたω-MVIICにより阻害されるが、ω -MVIICはN型にも弱く結合するので、P/Q型のみを選択的に阻害するコノトキシンは知られていない。そこ で筆者らはω-MVIICを出発物質としてP/Q型選択的なアナロー グの開発を目指した。先ず比較の対象として配列が類似している がN型のみを阻害するω-MVIIAの合成と立体構造解析をおこなっ た^14、15)。その結果ω-MVIIAとω-MVIICの立体構造はよく似てい たため、チャネルサブタイプの識別は立体構造の違いによるもの ではなく、構成アミノ酸の違いによるものと考えられた。そこで まずω-MVIIAとω-MVIICのキメラアナローグを合成した ^16、17)。その結果、N型に対する結合は分子の前半部分で決まるのに対し、 P/Q型では結合部位は分子全体に広がっていることが示唆された。 さらにω-MVIICに関して系統的なAla置換をおこなった結果、 Lys2、Thr11、Tyr13の置換が両方のサブタイプに対する親和性 を減少させたのに対し、P/Q型に対してはLys4やArg22の置換 でも大きな親和性の低下が見られた¹⁸⁾。このように ω-MVIICの場合はμ-GIIIAやω-GVIAに見られたほど顕著な機能ドメインの分 離は見られない。これは、ω-MVIICの選択性のルーズさと関係し ているのかもしれない。

　ω-MVIICによるチャネルの選択性が特定の残基によるものでは ないことが示唆されたので、筆者らは複数の残基を同時に置換し て組み合わせの効果を調べることとした。そのために複数のアナ ローグを同時に混合物として合成するコンビナトリアル法を開発 した。通常のコンビナトリアル合成では装置から切り出した時点 でライブラリーは完成しているが、筆者らの場合、合成機から得 られるのは鎖状前駆体の混合物である。これを混合物のまま空気 酸化した後精製するというのが筆者らの戦略である。結果は予想 外に順調で、計6回の合成操作で50種近いアナローグを単離する ことが出来、その中にはP/Q型チャネルに高い選択性を示すもの も見出された¹⁹⁾。

　L型（α_1C）Ca²⁺チャネルはジヒドロピリジン誘導体により阻害 されるが、最近、C. textileから貝のジヒドロピリジン感受性のチャネルを阻害する ω-TxVIIが単離された²⁰⁾。ω-TxVIIは既知のω -コノトキシン類と異なり、酸性でかつ疎水性が非常に高いとい う特徴を持っており、そのため化学合成は困難であった。筆者ら は多くの条件を検討して、高濃度の有機溶媒を含むトリス塩酸緩 衝液がSS架橋反応に有効であることを見出し、大量合成に成功 した²¹⁾。さらにNMRによりω-TxVIIが3本のβ-ストランドより なる逆並行β-シート構造をとることを明らかにした²²⁾。今後ω-TxVIIの構造活性相関を解明することにより、詳細なCa ²⁺チャネル識別機構が明らかになると期待される。

8．λ-コノトキシン

　1998年にオーストラリアで開かれた国際会議で知り合ったシン ガポール大学のGopal博士からシンガポール産の種々の生物毒に 関して共同研究の申し出があった。その中に、分子内にSSを2本 もつコノトキシンが含まれていた。架橋様式を確認する目的で選 択的2段階法によりα-コノトキシン型のSS架橋（C1-C3, C2-C4）を形成させたところ天然物と全く一致しなかった。まさかと 思いながらC1-C4, C2-C3の組み合わせで合成したところ天然物と一致した。それがFig. 2に示すλ-コノトキシンである²³⁾。貝食性のイモ貝から単離された毒であるが、マウスの脳室内投与で、あ るものは興奮性作用を、あるものは弛緩性の作用を示す。まだ、具 体的な作用部位（チャネル）は特定されていないが今後の展開が 楽しみなペプチドである。

9．毒から薬へ

　ω-コノトキシンMVIIAは商品名ziconotideとして米国で Phase IIIの試験を終えて認可に向けた最終段階にあると聞いてい る。これまでの試験ではモルヒネの100倍から1000倍強力な鎮 痛効果が認められ、アメリカの大衆誌でも"From fish killer to pain killer"としてセンセーショナルに取り上げられたそうである。 ただし、開発の当事者に聞いたところではポンプで脊髄中に直に 送り込むという投与方法がネックになっているとのことであった。 そのためω-コノトキシンMVIIAの活性残基をテンプレートの上 にのせたモデル化合物の合成を試みている企業もある。研究用試 薬としての有用性は実証済みであるが、コノトキシンをリード化 合物とする医薬の開発はこれからが本番であろう。

参考文献

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