SOD Assay Kit - WST

Q1. SOD Assay Kit - WSTの測定原理を教えてください。

A1. 本キットの測定原理は下記の通りです。

Q2. 他の測定方法とはどのように違うのでしょうか？

A2. SOD活性を測定する方法としては、シトクロムc法、NBT 法、エピネフリン法および亜硝酸法などが知られています。 xanthine/xanthine oxidaseをスーパーオキシド生成系とし、テトラゾリウム塩の還元反応を利用したNBT法は操作が簡便 であることから汎用されていますが、生成するホルマザンが 不溶性の沈殿物であることや、NBTがxanthine oxidaseと直接反応し100％SOD阻害率を測定することができない等の 問題をかかえています。WST-1はxanthine oxidaseと直接反応しないため、100%SOD阻害率を測定できます。

Q3. 他のメーカーから販売されているキットとはどのように違う のでしょうか？

A3. 現在販売されているキットは2種類あります。A社のキット はNBTを用いているため（Q2）100％SOD阻害率を測定することができないということの他に、生成するホルマザンが 不溶性であることから試薬中に界面活性剤を含んでおり、ピ ペッティング時に気泡を生じる等操作性でも問題があります。
また、B社から販売されているキットは、1つの測定サンプル を調製するのに数分要するためマイクロプレートを用いるこ とができず、一度に多検体を測定するということができません。
それに比べ本キットは、水溶性ホルマザンを生成するWST- 1を使用しているためSOD阻害率も0〜100%まで測定することができますし、ピペッティング時に気泡を生じると いったこともございません。また、マイクロプレートを使用 し、一度に多検体の測定を行うことができます。

Q4. キット以外に必要なものは何ですか？

A4. キット以外に準備していただくものは下記の通りです。
･ プレートリーダー (450 nmフィルター)
･ 96 well プレート
･ 2-20 μl と 20-200 μl のマルチチャンネルピペット
･ インキュベーター
･ superoxide dismutase(SOD；阻害率の較正をする場合のみ)

Q5. マイクロプレートリーダーを持っていないのですが、測定で きますか？

A5. 測定サンプルを希釈するか、もしくは測定サンプルや試薬等 全ての量を増やすことで、分光光度計でも測定は可能です。た だし試薬等の量を増やして測定を行った場合測定できるサン プル数が減ってしまいますので、サンプル数を減らしたくな い場合はサンプルを希釈して測定を行ってください。
　また吸光度が不足する場合には、インキュベートの時間を プロトコールの20分から30分もしくは40分程度に延ばすことで対応できます。なお、測定には400〜450nmのフィ ルターをお使いください。

Q6. このキットでどのくらいの検体を測定することができるので しょうか？

A6. 96 wellのマイクロプレートを使用して測定を行った場合、1 キットで500検体の測定を行うことができます。

Q7. キットの保存はどのようにすればいいのでしょうか？また、 どのくらい保存できますか？

A7. 本キットは冷蔵庫（0〜5℃）で保存してください。
キットを開封し、試薬等の希釈を行った場合、それぞれの溶 液は以下の期間使用することが可能です。
･ WST working solution（WST solution 1 mlをBuffer solution 19 mlで希釈）
希釈後0〜5℃保存で2ヶ月使用できます。
･ Enzyme working solution（Enzyme solution 15μlをDilution buffer 2.5 mlで希釈）
希釈後0〜5℃保存で2週間使用できます。

Q8. どのような試料を測定することができますか？
また、その前処理方法について教えてください。

A8. 測定対象試料としては、血清, 血漿, 細胞, 組織, 食品等です。また、試料の前処理については、血清, 血漿は、そのままもしくは純水で希釈してお使いいただけます。全血からの赤血球の 採取方法についてはTsuchihashi法（Q9）をご参照ください。 その他の試料については弊社までお問い合わせください。

Q9. Tsuchihashi法とはどのような方法でしょうか？

A9. 以下に血漿、もしくは赤血球の測定試料とする場合の前処理 の例を示しますが、有機溶媒によるヘモグロビン除去の方法 の1つ（次項図２の四角で囲んだ部分）です。
ただし、このTsuchihashi法ではヘモグロビンが変性して除 かれる他に、Mn-SODも失活するとされるので、Mn-SODを有する細胞や組織にはこの方法は利用できず、灌流等によ る脱血が必要となります。

図2.　血漿及び赤血球試料の調製
（講談社「活性酸素測定マニュアル」より）

Q10. 測定に妨害を与える物質にはどのようなものがあります か？

A10. アスコルビン酸、グルタチオン（還元型）等還元物質は正誤 差を与えます。これらの物質が下記の濃度存在した場合10 ％程度のO.D.値の上昇が認められますが、O.D.値の上昇は blank 2として差し引くことにより影響は回避できます。
・ascorbic acid 0.1 mmol/l
・glutathione, reduced form 5 mmol/l
・bovine serum albumin (BSA) 5 %w/v
（BSAはO.D.値の上昇はありませんが、SOD様活性を示し ますのでこれよりも高濃度にはならないようにして下さい）

Q11. サンプルを希釈する際には、水で希釈してもいいのでしょうか？

A11. サンプルの希釈には添付のDilution bufferもしくは生理食塩水をお使いください。

Q12. 反応時間は厳密にしなくてはいけないのでしょうか？

A12. プロトコールではインキュベート時間を20分としていま すが、インキュベートの時間が10分〜60分の間で変わっても、得られるIC ₅₀値（反応の阻害率が50％）は変わりません（図3）。ただし、吸光度は時間と共に上昇していき ますので、ブランクとサンプルはインキュベートの時間が 常に同じになるようにして下さい。
　また、Enzyme working solutionを加えるとすぐにsuperoxideの発生が始まりますので、well間のタイムラグ をできるだけ少なくするために測定にはマルチチャンネル のピペットをお使いください。

Q13. SOD活性値はどのようにして求めればよいですか？

A13. SOD活性値は、一定時間（プロトコールでは20分）のイ ンキュベート後の吸光度の値から求められますし（end- point assay）、また、吸光度変化の傾きからも求めることができます（kinetic assay）。kinetic assayの場合、吸光度の上昇が直線を示すような適当なインキュベート時間から傾 きを求めてください。特にインキュベート開始後15〜20分の間では、吸光度の上昇は良好な直線性を示します。

それぞれの場合、SOD活性値は次の計算式により求められます。