酸化ストレスと遺伝子変異
Oxidative Stress and Mutagenesis

葛西　宏
(Hiroshi KASAI)
産業医科大学
産業生態科学研究所

紙谷　浩之
(Hiroyuki KAMIYA)
産業医科大学
産業生態系科学研究所

Summary
　DNA lesions produced by reactive oxygen species appear to be one of the causes of mutations that either occur spontaneously or are induced by environmental mutagens. During the past decade, studies on mutagenesis by oxidative stress have been focused on oxidized guanine, 8-hydroxyguanine. Recently, we found that oxidized adenine, 2-hydroxyadenine, is formed by Fenton-type reactions and that this DNA damage is as mutagenic as 8-hydroxyguanine when present either in DNA or in the nucleotide pool. These results suggest that 2-hydroxyadenine plays an important role in mutagenesis by oxidative stress.
　We review here the mutagenicity of 2-hydroxyadenine, which is observed in vitro and in vivo experiments carried out in our laboratory.
キーワード：活性酸素、ユーヒドロキシアデニン、DNA損傷、遺伝子変異

はじめに

　近年、DNAの損傷における活性酸素の役割に大きな関心が寄せられている。生体内で生じた活性酸素は、DNAやその前駆体と反応し、修飾する。DNAの修飾(損傷)は、塩基対形成の誤り(遺伝情報の変化)をもたらし、遺伝子変異や発癌を誘発すると考えられる。活性酸素は、化学物質・放射線等の環境変異原のみならず正常な好気的代謝の過程で産生されることから、酸化ストレスによって生ずるDNAの損傷は、化学発癌・放射線発癌において重要なだけではなく、自然突然変異の重要な因子であると思われる。ここでは、酸化ストレスによって生ずるDNA損傷の一つである、2-hydroxyadenine(2-OH-Ade)とDNA前駆体に生じた酸化的損傷、2-hydroxy-dATP(2-OH-dATP)の誘発する変異について述べる。

1.試験管内反応における2-OH-Adeの生成

　活性酸素によって塩基部、糖部が修飾を受けると、様々な種類のDNA損傷が生ずる。特に著名なのが 8-hydroxyguanine(7,8-dihydro-8-oxoguanine, 8-OH-Gua)で、活性酸素を産生する環境変異原によって生ずることが数多く報告されているDNA損傷であり^(1,2)、細胞内で主としてG→T変異を誘発することが明らかにされている^(3-7)。　最近、私達は、DNA、dA、dATPを活性酸素産生系である Fe²⁺-EDTA-O₂で処理すると、塩基部が水酸化され、2-OH-Ade(図1)が生ずることを見い出した⁽⁸⁾。また、腎発癌物質であるニトリロ三酢酸(NTA)と Fe²⁺との錯体の系(Fe²⁺-NTA-O₂)でも2-OH-Adeが生成することを見い出している⁽⁹⁾。モノマー(dA)をFe²⁺-EDTA-O₂やFe²⁺+-NTA-O₂処理した場合、細かい条件の違いにより若干の変動はあるが、2-OH-Adeの生成量は8-OH-Guaとほぼ同程度であった^(8,9)。細胞内でも同様に、モノマーにおいてはこの両者は同程度生成すると推定される。一方、DNAをFe²⁺-EDTA-O₂処理した場合には、2-OH-Adeは8-OH-Guaの1/40程度しか生成しなかった⁽⁸⁾。従って、DNA中のアデニン残基が直接酸化されて2-OH-Adeが生成する割合はあまり高くないと思われる。

2.DNA中に2-OH-Adeが生成するルート

　上記のように、2-OH-Adeは、DNA中では生成量が低いと予想されるが、このことは変異誘発に2-OH-Adeは関与していないことを意味するのであろうか。
　ヌクレオチドプールに生じる酸化的損傷ヌクレオチド、8-hydroxy-dGTP(8-OH-dGTP)を加水分解する酵素(MutT蛋白質)は、mutTとして知られていた大腸菌のミューテーター遺伝子にコードされている⁽¹⁰⁾。このことは、DNA中のグアニン塩基の直接的な酸化によって生成する8-OH-Guaのみならず、損傷DNA前駆体の8-OH-dGTPもDNAに取り込まれることにより、変異を誘発することを示している。類推すると、2-OH-Adeの場合にもこの2つのルートによって2-OH-Adeが DNA中に生成すると考えられる。ただし、2-OH-Adeの場合、DNA中での生成から相対的に少ないことから、生成した2-OH-dATPのDNAポリメラーゼによる取り込みが重要な経路であると考えられる。実際、私達は2-OH-dATPがDNAポリメラーゼの基質となることを明らかにしている(後述)。

3.DNA中の2-OH-Adeが誘発するヌクレオチドのミスインコーポレーション

　私達は、2-OH-AdeがDNAポリメラーゼによる試験管内DNA合成の系において、ヌクレオチドのミスインコーポレーションを誘発するかどうかを調べた。5'-及び3'-隣接塩基を色々と置換した、2-OH-Adeを含む12種類のオリゴヌクレオチドを合成し、鋳型DNAとして用いた。各鋳型DNAにプライマーをアニールさせ、1種類の基質(dNTP, N=A,G,C,T)を加えた緩衝液中でDNAポリメラーゼ(ポリメラーゼα及びβ、クレノー断片)によるプライマー伸長を行ったところ、配列によって若干の違いがあるものの、(1)ポリメラーゼαとβではdTMPとdCMPが、(2)クレノー断片ではdTMPとdGMPが取り込まれる傾向を観察した⁽¹¹⁾。興味深い点は、5'-TA^*A-3'(A^*=2-OH-Ade)配列中の2-OH-Adeに対しては3種のポリメラーゼともdAMPを取り込んだことである^(11,12)。また、2種の鋳型DNAを用い、4種類のdNTP存在下でのポリメラーゼ反応で得られた、完全鎖長産物を解析したところ、TA^*A配列の場合にはdAMPの取り込みが、そうでない配列(この場合は5'-GA^*C-3'配列)ではdCMPの取り込みが観察された。
　以上の結果から、2-OH-Adeは試験管内の系においてヌクレオチドのミスインコーポレーションを誘発することが明らかになった。

4.DNA中の2-OH-Adeが細胞内で誘発する変異

　私達は、上記の結果を踏まえて、2-OH-Adeの大腸菌及び培養細胞における誘発変異を解析した。標的配列はスクリーニングを考慮し、制限酵素部位、5'-GTCGA^*C-3'(Sal1部位)と5'-CTTA^*AG-3'(AfI2部位)に導入した、後者はdAMPの取り込みが観察されたTA^*A部位中の2-OH-Ade、前者はその他の部位の2-OH-Adeを想定したものである。2-OH-Adeを含むオリゴヌクレオチドを二本鎖シャトルベクターpSVK3に導入し、大腸菌及びサル由来のCOS-7細胞にトランスフェクションした。その際に、複製の際のリーディング、ラギング鎖合成の違いを観察するために、二本鎖のそれぞれの鎖に2-OH-Adeを導入したプラスミドを構築した^(13,14)。
　図2に大腸菌、COS-7細胞中での誘発変異率を示した。大腸菌、COS-7細胞ともにGA^*C配列の2-OH-Adeの変異率はラギング鎖合成時では0.6～0.8%で、リーディング鎖合成時よりも高い。一方、TA^*A配列中の2-OH-Adeの変異率はそれよりも低く、リーディング、ラギング鎖合成時ともに0.1%程度であった。TA^*A配列は、上述したようにdAMPの取り込みが試験管内で観察された、やや特殊な配列であり、それを考慮すると2-OH-Adeの変異率は、約0.5%であると推定される。この変異率には、相補鎖(2-OH-Adeを含まない鎖)の複製も反映されるため、実際の変異率は約1%であると推定される。この値は、二本鎖DNAを用いて得られている8-OH-Guaの変異率と同程度である^(4-7)。従って、DNA中に生じた2-OH-Adeは8-OH-Guaと同程度に変異を誘発すると言える。
　GA^*C配列中の2-OH-Gdeは、大腸菌、COS-7細胞のいずれの場合にも、ラギング鎖合成時にアデニンの欠失変異を誘発した。同様にTA^*A配列中の2-OH-Adeの誘発変異にもアデニンの欠失変異がラギング鎖合成時に観察されている。この欠失変異が生ずる機構は、2-OH-Adeに対してdCMP(GA^*C)またはdAMP(TA^*A)が取り込まれた後、misalignmentが生じた結果であると思われる^(13,14)。リーディング鎖合成時の際には、欠失変異の割合が減少した。これは、前述のモデルから考えると、2-OH-Ade・Cまたは2-OH-Ade・Aからの伸長がリーディング鎖合成時の方が高いことを示唆する。従って、GA^*C配列の2-OH-Adeに対してはdCMPが取り込まれてA→G変異またはAの欠失変異が誘発され、TA^*A配列中の2-OH-Adeに対してはdAMPが取り込まれてA→T変異とAの欠失変異が誘発されたと考えられる。この結果は、試験管内での結果と概ね一致する。興味深いことは、TA^*A配列中の2-OH-Adeが大腸菌、COS-7細胞のいずれの場合にも、A→G変異をも誘発したことである。これは、細胞内でDNAポリメラーゼ3(大腸菌)やポリメラーゼδまたはε(COS-7細胞)がTA^*A配列中の2-OH-Adeに対してもdCMPを取り込んだことを示している。また、大腸菌では、低頻度ながらA→C変異が観察されている。このことは、ポリメラーゼ3が 2-OH-Adeに対してdGMPを取り込んだことを示す。
　以上のデータをまとめると、2-OH-Adeは8-OH-Guaと同程度に変異原性を有し、そのスペクトルは、主としてA→G変異、5'-隣接塩基がGの場合には、A→Gの他にAの欠失、TA^*A配列の場合には、A→T、A→G変異と欠失変異であると結論づけられる。

5.2-OH-dATPのDNAポリメラーゼによる取り込み

　次に、ヌクレオチドプール中に生ずると思われる2-OH-dATPのDNAポリメラーゼによる取り込みを検討した。合成オリゴヌクレオチドを用いた鋳型-プライマーを用い、2-OH-dATPを基質として与えてDNAポリメラーゼ反応を行ったところ、プライマー鎖の伸長が観察された。哺乳動物細胞の複製酵素であるDNAポリメラーゼαの場合には、鋳型中のTまたはC残基に対して、取り込みが観察された⁽⁸⁾。一方、大腸菌の複製酵素、DNAポリメラーゼ3の場合には、鋳型DNA中のTとG残基に対して2-OH-dATPが取り込まれた(紙谷ら、未発表データ)。すなわち、哺乳動物のDNAポリメラーゼαにより2-OH-Ade・C対が、大腸菌DNAポリメラーゼ3により2-OH-Ade・G対が形成される(図3)。このポリメラーゼ依存的に形成される塩基対の違いの機構についての詳細は現在不明である。このように、2-OH-dATPは、哺乳動物・大腸菌のいずれの複製酵素によっても誤った対合を行うことが明らかになった。

6.2-OH-dATPが細胞内で誘発する変異

　私達は、損傷を受けたDNA前駆体(デオキシヌクレオシド三リン酸)が細胞内で誘発する変異のアッセイ系を新たに開発し、2-OH-dATPが細胞内で誘発する変異を調べた。この方法は、大腸菌懸濁液に損傷ヌクレオチドを添加して取り込ませ、染色体DNA上のlac I遺伝子中に生じた変異を解析するものである⁽¹⁵⁾。
　最初に、様々な濃度のヌクレオチドを添加し、lac Iまたはlac 0遺伝子座における変異体率を求めた。未修飾のdATPやdGTPの添加では、量依存的に変異体率の上昇が観察された。このことは、外から添加した損傷ヌクレオチドが大腸菌体内に取り込まれて変異を誘発したことを示唆する。事実、放射性同位元素で標識したヌクレオチドを添加した場合には、菌体内への放射性同位元素の移行が観察されている。
　次に、変異体のlac I遺伝子の配列を解析した。図4に変異の大まかな内訳と変異率の相対値を示した。その結果、塩基置換変異の頻度は、2-OH-dATPの添加により約9倍上昇したことが明らかになった。8-OH-dGTPの場合にはその上昇率は約12倍であった。この結果を標識ヌクレオチドを用いて調べた菌体内への取り込み効率に照らし合わせると、2-OH-dATPの方が8-OH-dGTPより約3倍変異原性が高いことが明らかになった。このことは、ヌクレオチドプール中に生じた2-OH-dATPが活性酸素が関与する変異に極めて重要な役割を担っていることを示唆するものである。
　2-OH-dATPによって誘発された塩基置換変異の84%はG・C→T・Aトランスバージョンであった⁽¹⁵⁾。一方、8-OH-dGTPによって誘発された塩基置換変異は、ほとんどが A・T→C・Gトランスバージョンであった。8-OH-dGTPの誘発変異は、分解酵素活性を欠くmutT株大腸菌で見い出される変異や試験管内でのDNAポリメラーゼ反応の結果から予測されていた変異と同一のものであった。このことは、新たに開発した実験系が有効なものであることを示している。2-OH-dATPが誘発したG・C→T・Aトランスバージョンの生成機構としては、最初の複製の際に鋳型DNA中のG残基に対して2-OH-dATPが挿入され、次の複製の際に2-OH-Ade残基に対してdTTPが取り込まれることが推定される。事実、最近の私達の実験で、大腸菌の複製酵素、DNAポリメラーゼ3が鋳型DNA中のG残基に対して2-OH-dATPを取り込むことを見出している(紙谷・葛西、未発表データ;紙谷ら、未発表データ)。
　2-OH-dATPは8-OH-dGTPよりも変異原性が高く、また、G・C→T・Aトランスバージョンを誘発することは大いに着目されるべきことである。以前には、活性酸素によりG・C→T・A変異の頻度が上昇すると、それはDNA中に生じた8-OH-Guaの誘発変異だと(確かな根拠もなく)思われてきた。しかし、著者らの結果は、G・C→T・Aトランスバージョンの誘発には、少なくとも2-OH-dATPの生成が関与する可能性を示唆している。
　また、5.で述べたように、in vitroにおいてDNAポリメラーゼαが2-OH-dATPを鋳型DNAのCに対して取り込んだことを考慮すると、哺乳動物細胞中ではG・C→T・Aトランジッションが誘発されると推定される。

おわりに

　以上、DNA中の2-OH-Ade、ヌクレオチドプールに生ずる2-OH-dATPが 8-OH-Gua、8-OH-dGTPに匹敵する変異原性を有する、重要な酸化的損傷であることが明らかになった。また、8-OH-dGTP分解酵素として知られていたヒトMTH1蛋白質が、2-OH-dATPを8-OH-dGTPよりも効率よく分解することも、この損傷の重要性を強く示唆する⁽¹⁶⁾。

参考文献
1)Kasai, H.(1997)Analysis of a form of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, as a marker of cellular oxidative stress during carcino-genesis. Mutation Res., 387, 147-163.
2)紙谷浩之、葛西宏(1995)活性酸素による8-ヒドロキシグアニンの生成と生体との関わり. 衛生化学, 41, 307-319.
3)Wood, M. L., Dizdaroglu, M., Gajewski, E. and Essigmann, J. M.(1990)Mechanistic studies of ionizing radiation and oxidative mutagenesis: genetic effects of a single 8-hydroxyguanine(7-hydro-8-oxoguanine)residue inserted at a unique site in a viral genome, Biochemistry, 29, 7024-7032.
4)Cheng, K. C., Cahill, D. S., Kasai, H., Nishimura, S. and Loeb, L. A.(1992)8-Hydroxyguanine, an abundant form of oxidative DNA damage, causes G→T and A→C substitutions, J. Biol. Chem., 267, 166-172.
5)Kamiya, H., Miura, K., Ishikawa, H., Inoue, H., Nishimura, S. and Ohtsuka, E.(1992)c-Ha-ras containing 8-hydroxyguanine at codon 12 induces point mutations at the modified and adjacent positions. Cancer Res., 52, 3483-3485.
6)Kamiya, H., Murata-Kamiya, N., Koizume, S., Inoue, H., Nishimura, S. and Ohtsuka, E.(1995)8-Hydroxyguanine(7,8-dihydro-8-oxoguanine)in hot spots of the c-Ha-ras gene. Effects of sequence contexts on mutation spectra. Carcinogenesis, 16, 883-889.
7)J. Wagner, Kamiya, H. and Fuchs, R. P. P.(1997)Leading versus lagging strand mutagenesis induced by 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in E. coli. J. Mol. Biol., 265, 302-309.
8)Kamiya, H. and Kasai, H.(1995)Formation of 2-hydroxydeoxy-adenosine triphosphate, an oxidatively damaged nucleotide, and its incorporation by DNA polymerases, J. Biol. Chem., 270, 19446-19450.
9)Murata-Kamiya, N., Kamiya, H., Muraoka, M., Kaji, H. and Kasai, H.(1997)Comparison of oxidation products from DNA components by γ-irradiation and Fenton-type reactions. J. Radiat. Res., 38, 121-131.
10)Maki, H. and Sekiguchi, M.(1992)MutT protein specifically hydrolyses a potent mutagenic substrate for DNA synthesis, Nature, 355, 273-275.
11)Kamiya, H. and Kasai, H.(1996)Effects of sequence contexts on misincorporation of nucleotides opposite 2-hydroxyadenine, FEBS Lett., 391, 113-116.
12)Kamiya, H., Ueda, T., Matsukage, A. and Kasai, H.(1995)Misincorporation of dAMP opposite 2-hydroxyadenine, an oxidative form of adenine. Nucleilc Acids Res., 23, 761-766.
13)Kamiya, H. and Kasai, H.(1997)Substitution and deletion mutations induced by 2-hydroxyadenine in Escherichia coli: Effects of sequence contexts in leading and lagging strands. Nucleic Acids Res., 25, 304-310.
14)Kamiya, H. and Kasai, H.(1997)Mutations induced by 2-hydroxyadenine on a shuttle vector during leading and lagging strand syntheses in mammalian cells. Biochemistry, 36. 11125-11130.
15)Inoue, M., Kamiya, H., Fujikawa, K., Ootsuyama. Y., Murata-Kamiya, N., Osaki, T., Yasumoto, K. and Kasai, H.(1998)Induction of chromosomal gene mutations in Escherichia coli by direct incorporation of oxidatively damaged nucleotides. J. Biol. Chem., 273, 11069-11074.
16)Fujikawa, K., Kamiya, H., Yakushiji, H., Fujii, Y., Nakabeppu, Y. and Kasai, H.(1999)The oxidized forms of dATP are substrates for the human MutT homologue, the hMTH1 protein. J. Biol. Chem., 274, 18201-18205.

著者紹介

氏　　名	葛西　宏(Hiroshi KASAI)
所属名	産業医科大学産業生態科学研究所
出身大学	学習院大学大学院自然科学研究科
学位	理学博士
専門	化学発癌、DNA損傷
連絡先	〒807-8555　北九州市八幡西区医生ヶ丘1-1
	Tel：093-691-7468,Fax：093-601-2199

氏　　名紙谷　浩之(Hiroyuki KAMIYA)

所属名産業医科大学産業生態科学研究所

出身大学北海道大学大学院産業生態科学研究科

学位薬学博士

専門核酸化学、分子生物学

趣味野球（最近はニュースでの鑑賞のみ）

連絡先〒807-8555　北九州市八幡西区医生ヶ丘1-1

氏　　名	紙谷　浩之(Hiroyuki KAMIYA)
所属名	産業医科大学産業生態科学研究所
出身大学	北海道大学大学院産業生態科学研究科
学位	薬学博士
専門	核酸化学、分子生物学
趣味	野球（最近はニュースでの鑑賞のみ）
連絡先	〒807-8555　北九州市八幡西区医生ヶ丘1-1

酸化ストレスと遺伝子変異 Oxidative Stress and Mutagenesis