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-Nucleostain- DNA Damage Quantification Kit　-AP Site Counting-

【はじめに】

　生物の遺伝情報を保持しているDNAは、複製時のDNA polymeraseのエラーに加えて、環境中の放射線や紫外線、またはアルキル化剤等の化学物質、生体内における活性酸素等の代謝産物により損傷を受けます。これらのエラーや損傷が正しく修復されなければ突然変異を誘発し、これが癌や老化の原因となることもあります。
　DNA損傷部位には修復機構が働きますが、その一つとして塩基除去修復があります。この時AP site(apurinic/apyrimidinic site)と呼ばれる塩基除去部位が出現します。つまりAP siteを検出することによりDNA損傷を測定することができます。
　-Nucleostain- DNA Damage Quantification Kitは、AP siteと特異的に結合するARP(N'-Aminooxymethylcarbonylhydrazino-D-biotin)を用いてDNAをビオチン化し、96穴マイクロプレートに固相化して試料DNA中のAP siteを簡便に定量できるキットです。

1.キット内容(5 sample用)

2.DNAの精製

　このキットによるDNAのAP site数検出は混在するRNAおよびタンパクにより測定誤差を生じる可能性がありますので、RNase 処理後、フェノール/クロロホルムもしくは他のDNA精製キット等を用いて精製したDNAを使用することお薦めします。
　また最近では、数多くのDNA精製キットが市販されるようになり簡便にDNAを単離精製することが可能です。中でもグアニジン/界面活性剤による精製法は簡便でかつ高純度のDNAを得ることができます。
　DNAの純度は吸光度比(A 260nm/A 280nm)により検定することができます。A 260nm/A 280nm≧1.8のDNAを使用することを推奨します。

3.操作方法

1.試料DNAのARP標識

操作

1)精製した試料DNAをTE bufferに溶解させ、溶液の吸光度(260nm)を測定する。吸光度から濃度を算出して(DNA濃度は50μg/mlの時の吸光度を1.0として算出)100μg/mlの濃度になるようにTE bufferで希釈調製する。
2)試料DNA溶液10μlにARP溶液10μlを0.5mlチューブ中で混合する。
3)37℃で1時間反応させる。
4)380μlのTE-bufferを添加後、溶液をFiltration Tubeに入れる(Filtration Tube操作図を参照)。*
5)遠心分離(2,500g、15分間)後、ろ液を捨てる。**
6)400μlのTE-bufferをFiltration Tubeに加え、フィルター上に付着したDNAをピペッティングにより溶解させる。
7)遠心分離(2,500g、15分間)後、ろ液を捨てる。***
8)400μlのTE-bufferをFiltration Tubeに加え、フィルター上に付着したDNAをピペッティングにより溶解させる。
9)DNA溶液を1.5mlチューブに移し、0-5℃で保存する。

*　　Filtration Tubeの代わりにエタノール沈殿による精製も可能です。
**　溶液がメンブラン上に残っている場合は、更に2,500g、5分間遠心分離します。
***Filtration Tubeを使用した場合、DNAの回収率は90%です。従って、溶液中のARP標識DNA濃度は2.25μg/mlとなります。

2.AP site数の検出
2-1　試薬

2-2　操作
1)APR標識DNA 90μlにTE buffer 310μlを加える。
2)各標準ARP-DNAを1well当たり60μlずつ3 wellに添加する(プレート配置図参照)。
3)ARP標準DNAを1well当たり60μlずつ3 wellに添加する。
4)DNA Binding Solution 100μlをDNAの入ったwellに添加し数回ピペッティングにより攪拌後、室温に一夜放置する。*
5)wellの中の溶液を吸引等により除去し、洗浄用PBSTでwellを5回洗浄する。**
6)希釈HRP-Streptavidin 150 μlを各wellに添加し、37℃、1時間インキュベートする。
7)well中の溶液を吸引等により除去し、洗浄用PBSTでwellを5回洗浄する。**
8)発色溶液100μlを各wellに添加し、37℃、1時間インキュベートする。
9)マイクロプレートリーダーにより吸光度を測定する。630-670nmの波長フィルターが使用可能である。
10)DNA中のAP site数を検量線から算出する。

標準AP-DNA(60μl/well)あるいはsample DNA(60μl/well) +DNA Binding Solution(100μl/well)

*　あらかじめエッペンチューブ中で標準ARP-DNAおよびARP標識DNAとDNA Binding Solutionを3:5の体積比で混合調製し、その溶液をwellに各々160μl添加することも可能です。
**洗浄後は敷いたペーパータオル上などの上でプレートを叩いてwell中の洗浄用PBSTを完全に除いて下さい。

4.注意事項

1.キットは0-5℃で保存し、凍結させないで下さい。
2.AP-DNAは一般に不安定ですので、測定対象DNAを単離精製後は直ちにARP反応を行ってください。ARP化DNAのTE buffer溶液は0-5℃で1年安定です。
3.Filtration Tubeでの遠心分離後は直ちにTE bufferを添加しDNAを溶解させてください。長時間DNAをメンブラン上で放置しておきますと、DNAのメンブランへの吸着が起こり回収率にバラツキを生じる可能性があります。
4.γ線滅菌のチューブはDNAの吸着を生じる可能性がありますので、チューブを使用の際は非滅菌チューブを必要に応じてオートクレーブ滅菌して使用することを推奨します。
5.630-670nmのフィルターをお持ちでない場合は、発色反応後、各wellより50μl抜き取り新しいプレートに移します。同量の1mol/l硫酸を添加後、450nmの吸光度で測定することができます。
6.well洗浄後、残存する洗浄液により測定誤差を生じることがありますので完全に除いてください。

参考文献
1)Sancar, A. and Sancar, G. B., Annu. Rev. Biochem., 57, 29-67(1988).
2)Lindahl, T. and Nyberg, B., Biochemistry, 11, 3610-3618(1972).
3)Liuzzi, M. and Talpaert-Borle, M., J. Biol. Chem., 260, 5252-5258(1985).
4)Weinfeld, M., Liuzzi, M. and Paterson, M. C., Biochemistry, 29, 1737-1743(1990).
5)Chen, B. X., Kubo, K., Ide, H., Erlanger, B. F., Wallace, S. S. and Kow, Y. W., Mutat. Res., 273, 253-261(1992).

コード番号 品名 容量 価格(\)
Request -Nucleostain- DNA Damage Quantification Kit-AP Site Counting- 5 sample 21,000

ご案内
本キット発売により、従来より販売しておりましたARP Kitは販売中止させていただきます。
ご了承下さいますようお願い申し上げます。
コード品　名容　量
347-07861ARP Kit1プレート