ニトロチロシンの生体内検出
　　Measurement of 3-nitrotyrosine in biological systems

澤　智裕 　（Tomohiro SAWA） 　熊本大学医学部微生物学教室 赤池孝章（熊本大学医学部微生物学教室助教授） 前田　浩（熊本大学医学部微生物学教室教授）

Summary
　Much attention has been given to a diverse function of nitric oxide (NO). Two different NO-dependent signal transductions are now known to occur in biological systems. One is cyclic GMP (cGMP)-mediated pathway via activation of soluble guanylate cyclase, the other is through cGMP-independent mechanism. Nitrosylation and nitration appear to be critically involved in various cGMP-independent biological phenomena caused by NO. It is now well conceivable that various oxidized forms of NO such as peroxynitrite and NOx, rather than NO per se, produce nitrosothiols and 3-nitrotyrosine. The biological significance of the tyrosine nitration is a major interest in this regard, because ample evidence indicates formation of 3-nitrotyrosine in vivo under various pathological conditions. A number of detection methods for nitrotyrosine are reported, however, only a few of them can be performed conveniently and reproducibly. Specific and sensitive measurement of 3-nitrotyrosine will be helpful to obtain a better understanding of physiological and pathological effects of nitration reaction in biological systems. The mechanism of biological nitration and its identification and quantification are reviewed in this article.
キーワード：ニトロチロシン、多電極型電気検出器、高速液体クロマトグラフィー、免疫組織化学、一酸化窒素、スーパーオキサイド、パーオキシナイトライト

1. はじめに

　近年、生体内における一酸化窒素（nitric oxide, NO）の多彩な生理活性が注目されている^{1, 2)}。NOは、比較的安定な無機ラジカルであるが、酸素ラジカルなどとは異なったユニークな化学的反応性を示す。生体内で生成したNOは、種々の酸化反応を介して最終的に比較的安定なNO₂^-やNO₃^-イオンとなるが、その過程でNOは、共存する分子状酸素（O₂）や酸素ラジカル（活性酸素）、さらには重金属（Fe, Cu）と反応することにより、より反応性に富む窒素酸化物が生じ、NOそのものには認められない多彩な活性が発現される。

　NOによるシグナル伝達には可溶性グアニレートサイクラーゼの活性化によるcGMPを介する経路と、cGMPに依存しないものがある。前者は、血管内皮依存性弛緩反応に代表される情報伝達メカニズムであるが¹⁾、後者の場合、NOそのものというより、NO由来の反応性窒素酸化物であるパーオキシナイトライト（ONOO^-）やN₂O₃, N₂O₄（NO₂）などによるニトロ化やニトロソ化反応を介する経路により、生体内の幅広い生命現象に関わっていることが明らかにされつつある^3-5)。

　特に最近では、パーオキシナイトライトなどによるチロシンのニトロ化反応が生体内のリン酸化反応を制御したり、アポトーシスを誘導することにより、細胞内あるいは細胞間のシグナル伝達や細胞死に深く関わることが示唆されている。従って、生体内で生成した３-ニトロチロシン（以下ニトロチロシン）検出法の確立は、パーオキシナイトライトなどの反応性窒素酸化物の生体内における生成の指標（バイオマーカー）としてだけでなく、それら反応性窒素酸化物の生物活性を解析する上で重要な課題である。本稿においては、生体内ニトロチロシン生成のメカニズムについて概説した後、現在主に用いられているニトロチロシン検出法について紹介する。

2. ニトロチロシン生成メカニズム

　Table1に、現在までニトロチロシン生成に関与することが示唆されている反応メカニズムをまとめた。パーオキシナイトライトはNOとO₂^-の反応産物である（２次反応速度定数6.7 × 10⁹ M^-1sec^-1）。我々は、マウスインフルエンザウイルス肺炎モデルにおいて、ウイルス性炎症に伴ってNOとO₂^-産生の共誘導がもたらされ、その結果、パーオキシナイトライトが過剰に産生されること、さらに、このパーオキシナイトライトがウイルス感染病態の病原性発現に深く関わっていることを報告してきた^{6, 7)}。

Table1. 生体内ニトロチロシン生成メカニズム

　パーオキシナイトライト（ONOO^-）のpKaは6.8であるので、やや酸性側の生理的pH域ではパーオキシナイトライトはプロトン化され、ONOOH（peroxynitrous acid）の生成を経て、最終的には硝酸（イオン）になる。パーオキシナイトライト生成以後の反応の過程で、特にONOOHがHNO₃（NO₃^-）へと変換する間に、反応性の高い中間体が生じ、これがチオール化合物などの酸化をもたらすものと考えられている^{8, 9)}。パーオキシナイトライト（ONOO^-/ONOOH）の反応性は、・OH などの酸化反応に比べ劣っているが、パーオキシナイトライトは・OH とは質的に全く異なった興味ある反応性を示す。すなわち、パーオキシナイトライトはアミノ酸、特に蛋白質中のチロシン残基のニトロ化をもたらし^{3, 8, 9)}、核酸塩基、特にグアニンのニトロ化や水酸化を来す¹⁰⁾。さらに最近、パーオキシナイトライトのニトロ化反応が生体内に豊富に存在する（1.2 mM）二酸化炭素（CO₂）により促進されることが明らかにされた¹¹⁾。すなわち、パーオキシナイトライトがCO₂と直接反応し、生じたONOOCO₂^-が強いニトロ化活性を発揮すると考えられている。また、ONOO^-は、中性域において・OH より、はるかに安定でその寿命は数秒であり、より安定な生物活性を発揮し、多彩な生理活性を有することがわかっている^{8, 12)}。

　一方、最近Eiserichらは、パーオキシナイトライトに依存しない生体内ニトロチロシン生成メカニズムを提唱している¹³⁾。それは、ミエロパーオキシダーゼ（myeloperoxidase, MPO）とH₂O₂（＋Cl^-イオン）によるNO₂^-の過酸化反応によりNO₂Cl（未同定）が生じ、これが強いニトロ化反応をもたらすというものである。この反応は、好中球由来のMPOに依存した反応であるため、炎症局所における好中球浸潤の有無が、MPO依存性のニトロチロシン生成の前提条件となる。実際、ニトロチロシン抗体を用いた各種組織の免疫染色像を検討した場合、ニトロチロシンの局在は、好中球・マクロファージを中心に認められることが多い。またMPO以外にもNO₂^-の過酸化反応によるニトロ化を触媒する内因性パーオキシダーゼも存在することが示唆されており³⁾、今後、このシステムが生体内ニトロ化反応にどの程度寄与するかさらに検討が必要であろう¹³⁾。

3. ニトロチロシン検出法

　これまで試験管内でのチロシンニトロ化の解析には、主にUV検出器を接続した高速液体クロマトグラフィー（HPLC）が用いられてきた¹⁴⁾。しかしながら、生体内でのニトロチロシン生成量は、チロシン100残基に対して0.01¹⁵⁾〜0.8¹⁶⁾程度と報告されており、検出感度と特異性の点から通常のHPLC-UV法においてはいくつかの問題点が指摘されている。例えば、パーキンソン病やアルツハイマー病などの中枢神経系の病理組織中には、単波長のUV検出器を接続したHPLCでは区別できないアーチファクトの存在が示唆されており、HPLC-UVのみから求めた３-ニトロチロシンの値については疑問視されている¹⁷⁾。そのため、現在では以下に述べる分析手法が生体内でのニトロチロシン生成の検出に応用されている。

3.1 免疫化学的検出法

　現在、米国Upstate Biotechnology社などから抗ニトロチロシン抗体が市販されており、これを用いた免疫化学的検出が盛んに行われている³⁾。我々も、インフルエンザ感染マウス肺⁶⁾やサルモネラ菌感染マウス肝¹⁸⁾におけるニトロチロシン生成を免疫組織化学的に検出している。本法はニトロチロシン生成とともにその局在も同定できるという利点もあるが、定量性に乏しい。そのため、生体内ニトロチロシンの定量においては、以下に述べるような、感度および特異性に優れた検出法を応用しなくてはならない。

3.2 HPLC-電気化学検出器

　HPLC-電気化学検出法（HPLC-EC法）は、HPLCにより分離した化合物（AもしくはB）を電極セルへと導入し、その電極表面上で起こる酸化還元反応（式１）により、検出・定量する方法である。

A 　 B + e^-　　　(1)

HPLC-EC法は、蛍光検出器に匹敵する検出感度を持ち、また幅広い濃度範囲で直線性を有するなどの特徴から、核酸塩基の酸化物（８-オキソグアニンなど）をはじめとする様々な生体内物質の検出・定量に用いられている。ニトロチロシンに関しても、いくつかの動物モデルを用いて、その生成をHPLC-EC法により解析した報告がある。例えば、Shigenagaらは、サンプル中のニトロチロシンをsodium dithioniteにより還元し、アミノチロシンとして、EC法により検出する方法を報告している¹⁵⁾。しかしながら、生体試料中でのニトロチロシンの還元効率やアミノチロシンとしての収率などにいくつかの問題が残されている。また、単一電極によるHPLC-EC法では、試料に夾雑する物質との区別が困難な場合が多く、より特異的な検出法が望まれている。

3.3 HPLC-多電極EC法

　最近、Hensleyら¹⁶⁾、およびCrow¹⁹⁾により、HPLC-多電極EC法が、ニトロチロシン生成をより特異的に、しかも高感度に検出できる優れた方法であることが報告された。HPLC-多電極ECでは、通常８〜12個の電極セルが直列に接続され、HPLCで分離された試料はそれら多電極へ次々と導入される。その結果、一つの溶出時間に対して一度の測定で多数の電圧-電流関係を求めることが可能となる。例としてチロシン、クロロチロシン、ニトロチロシンをHPLC-多電極EC（CoulArray, ESA社）で検出した結果をFig.1に示す。図では300 mVより50 mVずつ電圧を上げているが、それぞれの化合物が異なる電圧において酸化反応をしていることが分かる。このときのピーク面積の累積値を印加電圧に対してプロットしたものがFig.2である。このようなプロファイルはそれぞれの化合物に固有であることから、HPLCによる溶出時間とあわせてピークを同定する上で、大変有用な知見を与える。

　多電極ECにおいても単電極EC同様、高感度な検出が可能である。多電極ECでは、さらに電極が直列に接続されているために、一つ前の電極がガードセルとしての役目も果たす。そのため、単電極に比べ、よりノイズが抑えられる結果として、より高い感度が実現される。Fig.3には750 mVにおけるニトロチロシン量とピーク面積との関係を示している。今回、検討した結果では0.1 pmol（50μl injection）まで検出可能であった。

　タンパク質内に結合しているニトロチロシンを検出するためには、何らかの方法でタンパク質をアミノ酸まで分解することが必要である。Fig.4には、コントロール（無処理）のウシ血清アルブミン（BSA）あるいはパーオキシナイトライトで処理したBSAを、Waters社製のタンパク質加水分解装置（Pico-Tag）を用いて、6N HCl、110℃、12時間、酸加水分解した試料をHPLC-多電極ECにて分離した結果を示している。アミノ酸混合物においてもニトロチロシンがきれいに検出され、またこの条件においては、チロシン（約９分に溶出）も同時に分離・定量が可能であるため、タンパク質中のチロシンニトロ化率を、全チロシン残基中のニトロチロシン残基量として求めることができる。この他に、蛋白質分解酵素を用いる方法も報告されている^{16, 19)}。

　上述したように、我々はインフルエンザ感染マウス肺においてニトロチロシンが生成していることを免疫組織化学的に明らかにしてきた。そこで今回、本システムを用いて感染マウス肺内に生成したニトロチロシンの定量を試みた。Fig. 5a には、インフルエンザ感染７日後のマウス肺ホモジネートを上記の酸加水分解した試料のHPLCプロファイルを、標品のニトロチロシンのそれ（Fig. 5b）とともに示す。このときの肺内のニトロチロシン量は、0.03/100チロシン残基と見積もられた。このように本システムにより、生体内のニトロチロシン生成が感度良く定量できることが示された。

3.4 ガスクロマトグラフィー法

　Ohshimaら²⁰⁾、およびPetruzzelliら²¹⁾によりガスクロマトグラフィー法（GC法）でのニトロチロシン検出法が報告されている。Petruzzelliらによるとthermal energy analysis（TEA）を組み合わせたGC-TEA法では、ニトロチロシンの検出限界が 37 pmol/mg proteinとなり、Ohshimaらの方法に比べて25倍の感度向上がみられるという。しかしながら、我々は上述した多電極型ECを接続したHPLC法により、さらに10倍以上感度良くニトロチロシンを検出できることを確認している。

4. HPLC-多電極ECによるニトログアノシンの検出

　パーオキシナイトライトはチロシン以外にも様々な生体分子に対して酸化やニトロ化をもたらす。Yermilovらは、パーオキシナイトライトが核酸塩基グアニンの８位を効率よくニトロ化することを報告している¹⁰⁾。生成した８-ニトログアニンの生物学的な意義は未だ不明であるが、YermilovらはDNA鎖上に生じた８-ニトログアニンが自発的に脱塩基反応を起こし、アベーシック部位を形成することを示している¹⁰⁾。DNA複製においてアベーシック部位の向かい側にはアデニンが取り込まれやすくなることが知られており²²⁾、Yermilovらは８-ニトログアニンがアベーシック部位形成を介してG→T変異を誘発する可能性があると示唆している¹⁰⁾。一方、Szaboらは、パーオキシナイトライトによるDNA鎖切断がアポトーシスを起こす引き金となる可能性を示唆している²³⁾。これらのことから、８-ニトログアニンは核酸とパーオキシナイトライトとの反応を知るためのバイオマーカーとしても注目されている。

　これまでニトログアニンは、HPLC-UV法²⁴⁾や、ニトロ基を一旦アミノ基へ還元した後HPLC-EC法¹⁰⁾により検出されていた。今回、我々は上述したHPLC-多電極EC法によるニトログアノシンの検出を試みた。その結果、Fig.6に示すように、他の正常ヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン）の混合試料中から８-ニトログアノシンを良好に分離でき、しかも還元などの処理を行うことなく８-ニトログアノシンそのものを検出することができた。

5. まとめ

　以上述べてきたように、HPLC-多電極ECは、生体内ニトロチロシン生成を高感度に、しかも特異的に検出・定量できる優れた方法であることが示された。今後、免疫組織化学法と組み合わせた解析を行うことでより詳細な生体内ニトロ化反応の解析が可能になるものと期待される。

参考文献
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