ニトロソチオールの検出法

Quantitation and Identification of Various Nitrosothiols in Biological Systems

赤池　孝章
(Takaaki AKAIKE)
熊本大学医学部微生物学教室

Summary
Nitrosothiols (thionitrites: RS-NOs) seems to be critically involved in a diverse array of biological phenomena. In this review, the basic and chemical properties of RS-NOs are described, and subsequently introducing the RS-NO analytical technique that has been used for detection of RS-NO formation in biological system. Of considerable importance of the RS-NO chemistry is the fact that formation and disintegration of RS-NOs are catalyzed by some kind of heavy metal ions, of which reaction mechanism is only partly clarified. In this regards, a most conventional quantification reported by Saville several decades ago is based on the stoichiometric decomposition of RS-NOs to NO2- (or NO+) by Hg2+ ion. There are a number of analytical methods for RS-NO determination including uv/visible spectroscopy, fluorescence spectroscopy, and the high performance liquid chromatography (HPLC) analysis which combined chemiluminescence or electrochemical detector. However, so far a convenient and reproducible measurement for RS-NOs with sufficient specificity and sensitivity had not been available. Lately, we invented a novel RS-NO assay by use of HPLC coupled with a flow reactor system of metal ions and Griess reagent. Briefly, RS-NO was applied to the HPLC system of C18-reverse phase or a gel filtration column, and was eluted with 10 mM sodium acetate buffer (pH 5.5) with or without either methanol or 0.15 M NaCl. The eluate from the HPLC column is connected to mix with a solution containing HgCl2 for RS-NO decomposition in a reaction coil via the three-way connector. NO2- generated via the metal-induced RS-NO decomposition was then reacted with Griess reagent, which is infused through the second three-way connector, yielding a diazo-compound detected at 540 nm. The RS-NOs could be identified at nanomolar concentrations: detection limit, 3.0 nM. All of RS-NOs showed well-resolved elution profile even in the presence of NO2- and NO3-. Biological generation of GS-NO was quantitatively demonstrated with a macrophage cell line in culture stimulated with or without lipopolysaccharide and interferon-γ to express an inducible NO synthase. Because the physiological significance of RS-NO still remains obscure, specific and sensitive RS-NO detection techniques such as HPLC -flow reactor system as described in this review will be essential to analyze the formation and functions of RS-NOs in biological systems.

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はじめに

　近年、生体内における一酸化窒素（nitric oxide, NO）の多彩な生理機能が注目されている。NOは当初、血管内皮由来血管弛緩因子（endothelium-derived vascular relaxing factor, EDRF）の本態として同定されたガス状の無機ラジカル種であるが、Stamler らにより指摘された様に、NOはいくつかの酸化・還元状態をとり、例えばNO+ (nitrosonium cation)、NO- (nitroxyl anion）などのredox formsが存在することが予想されている1)。しかしながら、この様なNOのredox formの生体内生成と生理学的意義については不明な点が多い。最近我々は、NO+のキャリアー分子としてのニトロソチオール（nitrosothiol, RS-NO）の高感度で再現性、特異性ともにすぐれた検出方法を開発した。そこで本稿においては、まず、RS-NOの化学について簡単に解説した後、各種RS-NOのこれまで知られている検出法を概説し、最後に我々が開発したRS-NO定量法について述べる。

ニトロソチオールの化学的特性：RS-NOの生成と分解

　Stamlerらによりこれまで生体内におけるRS-NO生成についていくつかの報告がなされている2)。生体試料中に見出されるRS-NOは、低分子のものではグルタチン（reduced form of glutathine, GSH）や高分子のものでは血中のアルブミン（albumin）およびヘモグロビンのβ鎖などの蛋白の遊離（free）のcysteine残基のNO+の付加体である。この様なRS-NOはNOそのもののチオール基との直接的な反応によって生じるというより、以下の反応式（eq. 1-3）に示す、NOの酸化反応の過程で生じるNOx（N2O3）によって生成するものと思われる3)4)。

2NO + O2　→　2NO2 ･･････････ eq. 1
NO2 + NO　→　N2O3 ･･････････ eq. 2
RS-H + N2O3　→　RS-NO + NO2- + H+･･････････ eq. 3
2RS-H + 4NO + O2　→　2RS-NO + 2NO2- +2H+

　また興味あることに、最近、ロシアのVaninらはこの様なRS-NOの生成がFeイオンの存在下で促進することを見出しており5)、金属のチオール錯体とNOの付加体形成を介してRS-NO生成をもたらしていることを報告しているが、詳細は今だに不明である。
　一方、RS-NOの分解もまた、Cu 、Fe などの金属イオンにより触媒される。例えば、Cuイオンは以下の反応に示す様にRS-NOよりNOを放出させる6)7)。

RS-NO + Cu+　→　RS- + NO + Cu2+ ･･････････ eq. 4
2Cu2+ + 2RS-　→　2Cu+ + RS-SR ･･････････ eq. 5


　従って、Fe, Cuなどの重金属イオンは、RS-NOの生成促進作用と、分解という一見相反する化学反応を触媒するということになる。
　各種RS-NOの水溶液中での安定性は、溶液中に汚染している重金属イオンに大きな影響をうけるものと思われるが、一般に低分子のRS-NOのt1/2の方が（数時間〜10時間以上）、高分子のRS-NO（10時間以上）より短い傾向がある8)。これは、それぞれのチオール基の化学的反応性とともに、重金属イオンなどのRS-NOの分解を促す物質と、それぞれのRS-NOの構造上のaccessibilityに依存するものと思われる。生体内においても、同様な反応でRS-NOが生じ、さらに分解あるいはNOを放出しているものと思われるが、これまで世界中のどの実験室でも簡便に行える、特異性の高い方法がなかったためRS-NOのbiologyの解明は大変遅れていた。

ニトロソチオールの検出・定量法

（1）分光法
　比較的純度の高いRS-NOの場合、それぞれのRS-NOの吸収を分光学的に測定することにより定量することができる。例えば、ニトロソグルタチオン(GS-NO)の場合、紫外域では335 nm、可視域では540 nmの吸光度を測定し、それぞれの既知のモル吸光係数を用いて定量する8)。しかしながら、生体由来の粗サンプル中のRS-NOの検出定量には、さらに特異性の高い方法を用いなければならない。

（2）HPLC法
　逆相カラム（C18）やゲルろ過カラムを用いて、各種RS-NOを分離した後、UV検出器（335 nm）で、RS-NOのピークをモニターし測定することも可能である。しかしながら、RS-NOを特異的に検出するためには各種カラム溶出条件の選択についてかなりの工夫が必要であり、かつ、紫外域の検出であるため、その非特異なピークの検出もあり得る。特に高分子のS-NO蛋白などについては特に注意をはらう必要がある。
（3）重金属イオンを用いた検出法
　a. Savilleの方法
Savilleは1958年、Hg2+イオンを用いてRS-NOをNO2- へ分解（eq. 6 ）させた後、NO2- をGriess試薬にて定量することにより、RS-NOを簡便に測定できることを報告した。9)

RS-NO + Hg2+ + H2O → RSHg+ + HNO2 (NO+ + OH-) + H+･････ eq. 6

　本法においては、NO2-をGriess試薬を用いて定量する際、酸性下で反応させ、アゾ色素を生成させることが必要である（図１）。また、サンプル中にNO2-イオンが共存する場合、これがバックグランド値の上昇の原因となるため、生体サンプル中のRS-NOの高感度検出には適さないだけでなく、各種RS-NOを別々に同定することは出来ない。しかしながら、純度の高いRS-NOの定量においては信頼性のある方法である。
　b. 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)を用いた比色分析法
最近米国のWinkらのグループにより上述のSavilleの方法において用いられたGriess試薬のかわりに、ABTSを検出試薬として使用する方法が報告された10)11)。この方法においては、Savilleの方法と同様に、RS-NOをHg2+イオンにより分解させ、その過程で生じるNO+ (HNO2)とABTSを中性下で反応させるものである。この際、Hg2+イオンのかわりにCu2+イオンを用いることも可能であるが、RS-NOの分解はHg2+の方が定量的に、しかも効率よく進み、Hg2+は、RS-NOの側鎖（R鎖）の構造の影響をうけにくいと言われている7)。また、Cu2+によるRS-NOの触媒反応においては、Cu2+やCu+自身が溶在酸素と反応し、O2-やH2O2などの副産物の生成をもたらし、NOとの複雑な反応がもたらされる可能性もある。例えば、NOはO2-のほぼ拡散律速に近い速さで（6.7 × 109 M-1s-1）反応することが知られており12)、RS-NOの検出を妨げることも予想される。さらに、Cu2+ (Fe3+)イオンによるRS-NOの分解産物は、NOであるためこれがABTSなどと反応するためにはNOが溶在酸素（O2）と反応し、N2O3などのNOxの生成を介する必要があり、必ずしも定量的な評価ができないかもしれない。
さらに、ABTSを用いるWinkらの方法はバッチ法であり、個々のRS-NOを識別し同定することはできない。
　c. Diaminonaphthalene (DAN)を用いた蛍光分析法
さらにWinkらは、ABTSのかわりにDANを用いることにより、RS-NOがさらに高感度に検出できることを報告している11)。この際も、ABTSと同様にHg2+ (Cu2+)イオンによってRS-NOを分解させ、中性域の溶液中でDANとNO+を反応させ、生じるDAN由来のtriazene体を蛍光分光学的に分析し、RS-NOを定量するものである（図２）。triazene体は、アルカリ溶液中でEx. 375 nm Em. 415 nm (450 nm)にて蛍光を測定する。この方法での検出限界は50 nMであると記載されている。
しかしながら、ABTS, DANを用いるいずれの方法も様々な還元性物質（ascorbate, GSHなど）が反応を阻害するため、特に生体試料をバッチ法で測定する際は大きな欠点となる。
（4）HPLC-オゾン化学発光法、あるいは電気化学的検出法
　この方法は、Stamlerらが最初に生体試料のRS-NOの存在を示した際に用いられた方法で13)、実際は、Loscalzoらにより考案されたものである14)。本法は、各種RS-NOをまずHPLCにて分離した後、200Wの高圧水銀ランプを用いてUV照射 (300-400 nm) し、RS-NOのS-N結合を光分解させた後NOを放出させ、これをオゾン化学発光法によって検出するものである。検出限界は、10 nMであるとされている。この方法を用いて、ヒトの血液中のRS-NOの定量が行われており、正常ヒトの血（漿）中のRS-NOは7 μMでその96%程度がS-NO蛋白であると報告されている。
　しかしながら、この値は実際の値よりかなり多めに評価されていることが指摘されており、光分解によりRS-NOのみならずその他のNO付加体、例えばNOの金属(Fe2+など)付加体からもNOが放出され、非特異的反応がもたらされることが予測される。
　さらに、本法はどの実験室でも簡便に行えるものではなく、Stamlerらの報告は未だに十分な追試が行われていないというのが現状である。
　同時に、Loscalzoらは、HPLCにてRS-NOを分離した後、電気化学検出器 (electrochemical detector, EC検出器) を用いてRS-NOのピーク検出を行い、それぞれのRS-NOを検出定量する方法を報告しており、その検出感度は50 nMであるという14)。しかしながら、EC検出においても、RS-NOと同程度の酸化還元電位を持った物質が混在した場合、当然非特異的リスポンスの原因となり、本法が真に特異的定量システムとは言い難い。

（5）HPLC-Flow reactorによるRS-NOの検出・定量
　我々は最近、HPLC法にflow reactorシステムをカップリングさせることにより、すべてのRS-NOを高感度にしかも特異的に同定し、定量する分析法を開発した15)。
この方法は、RS-NOをHPLCで分離した後引き続き、flow reactor中の重金属（イオン）によってRS-NOを分解し生じるNO+ (NO) をさらにNO2-として検出し定量する方法である。図３にHPLC-flow recatorのフローダイアグラムを示す。
　すなわち、各種RS-NO、例えば低分子のRS-NO、GS-NOやCyS-NOなどは逆相カラム (C18-reverse pahse: TSK gel ODS-80Ts)、高分子のRS-NOであるS-nitroso-bovine serum albumin (S-NO-BSA) はゲルろ過カラム (Diol シリーズ: YMC) を用いて分離した後、以下に述べるいくつかのflow reactor中にて生じるアゾ色素を用いて検出する（図４）。
　RS-NOの分解のために２つの方法を用いる。第一の方法は、上述のSavilleの方法と同様に、Hg2+イオン (HgCl2) をflow reactor中に流出させ、定量的にNO2-イオンを生じさせる(eq. 6 参照)。この際のRS-NOからNO2-の変換効率を検討すると、Hg2+を含むflow reactor中で100%がNO2-に変化していることがわかる（図５）。このHg2+による反応は、RS-NOのR側鎖の構造に影響を受けず、高分子のニトロソ蛋白でも同程度の高い変換効率を維持できる。
　しかしながら、Hg2+イオンのかわりにCu2+イオンをflow reactorに使用した場合、RS-NOの30%程度しかNO2-に変換しておらず、前述したようにCu2+によるRS-NOからのNO2- 生成反応は必ずしも定量的には進行しない。
　一方、Hg2+やCu2+イオンによるflow reactorのかわり、Cu粒子をパッキングしたカラム（Cu-カラム）を用いてRS-NOを分解することも可能であり、このシステムにおいてもほぼ100%のNO2-生成がもたらされる。しかしながら、ニトロソ蛋白をCuカラムで処理した場合、蛋白のCu金属粒子への非特異的吸着がおこるため、高分子のRS-NOについてはCuカラムを用いることはできない。

　以上のHPLC-flow reactorシステムのRS-NOの検出感度は、低分子、高分子に拘らず、3 nM以上である（図６）。また、実際本法によって細胞よりのGS-NOを検出した例を図７に示す。これまで、NO合成酵素 (NO synthase, NOS) を発現した細胞からのGS-NOの生成を定量的に証明した例はないが、我々は、今回初めてリポポリサッカライド (lipopolysaccharide, LPS) とインターフェロン-γ (inteferon-γ, IFN-γ) によってマウスのマクロファージ細胞株 (RAW 264 細胞)を刺激し誘導型NOS (inducible NOS, iNOS)を発現させることにより16)、細胞よりGS-NOが生成することを示した（図７）。
　さらに、高分子のRS-NO、例えばS-NO-BSAについてもBSAをNOと反応させることでニトロソ体が生じることを明確に示すことができた（図８）。
　これらのデーターは、今回我々が開発したHPLC-flow reactorシステムが、すべてのRS-NOを高感度にしかも特異的に同定し、定量することができることを示しており、今後さらに様々な研究分野に応用されるものと思われる。


まとめ

　以上、これまで知られるRS-NOの検出法について概説した。NOは生体内で生じた後、そのレドックス状態を変化させることによりNOラジカルそのもでは発現できない生理活性を発揮していることが予想される。筆者は、今回紹介したRS-NOの分析法によりこれまで不明な点が多かったRS-NOの生物学的意義が解明され、NOの多彩な生理機能の一端が明らかにされることを期待するものである。


参考文献

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プロフィール
氏名　赤池　孝章　(Takaaki AKAIKE) 37歳
所属　熊本大学医学部微生物学教室・助教授
　　　　〒860　熊本市本荘2-2-1
　　　　TEL:096-373-5100　FAX:096-362-8362
　　　　E-mail: takakaik@gpo.kumamoto-u.ac.jp
出身大学　熊本大学大学院医学研究科
学位　医学博士
現在の研究テーマ
　　　　　ニトロソチオール生成の検出とその生物学的意義の解析
　　　　　パーオキシナイトライトの生物活性の解析

Takaaki Akaike, M. D., Ph. D. Associate Professor at Department of Microbiology, Kumamoto University School of Medicine, Kumamoto 860, Japan. 　Tel: 096-373-5100; Fax: 096-362-8362;