新製品

Cellstain 細胞染色用色素群

---

【はじめに】
-Cellstain-Double Staining Kit(-セルステイン-細胞二重染色キット)は、生細胞染色用蛍光色素Calcein-AMと、死細胞染色用蛍光色素PI(Propidium Iodide)を組み合わせたもので、生細胞及び死細胞を同時に染色することができる。
　Calcein-AMは、蛍光色素Calceinの四つのカルボキシル基をアセトキシメチル(AM)化して脂溶性を高め細胞膜透過性としたものである。それ自体蛍光を示さないが、生細胞の細胞膜を透過して細胞内に入ると、細胞内各種エステラーゼにより加水分解され黄緑色の強い蛍光を示すようになる。一方、PIは核酸染色色素の一つで、死細胞内に入り込み、細胞内のDNAの二重らせん構造にintercalateすることにより特有の強い赤色蛍光を示す。
　この作用の異なる二つの色素を用いることにより、生細胞は黄緑色に、死細胞は赤色に染め分けることができ、蛍光顕微鏡下の細胞観察はもちろん、更にはフローサイトメトリー、あるいはプレートリーダーを用いた細胞数の計測への応用が可能である。
　蛍光色素を利用した細胞染色は、Trypan blueを用いた分染法に代わる高感度な方法として期待される。
１)キット内容
A液・・・Calcein-AM stock solution(1mM)
Calcein-AM, 1mg/ml in DMSO, 50μl・・・・・・・・４vial
B液・・・PI stock solution(1.5mM)
PI, 1 mg/ml in H₂O, 300μl・・・・・・・・１vial

２)キットの保存及び取り扱い
このキットは密封して-20℃以下で冷凍保存すること。Calcein-AMは水分により加水分解する恐れがあるので、吸湿しないよう注意する。緩衝液や培養液などに希釈した染色溶液は、必要に応じて用時調製し、その日の内に使い切ること。PI溶液は冷凍保存すれば１年以上安定である。PIは発癌性の恐れがあるので、注意事項(注意事項４)を熟読の上、取り扱いには充分注意すること。

３)蛍光顕微鏡を使用した細胞形態観察
以下に、HeLa細胞を使用した場合の細胞染色の例を示すが、染色条件は細胞の種類、濃度などの観察条件によって変わるので注意のこと。条件に応じて細胞の固定や、試薬濃度の調整など最適条件を検討する必要がある。

3.1)染色溶液の調製
A液およびB液を室温に戻す。
5mlのPBS(-)溶液にA液10μl、B液15μLを入れる。これを染色溶液とする。この時、Calcein-AMは２μM、Plは４μMの濃度となる。

3.2)細胞染色
(１)HeLa細胞等の付着細胞はトリプシン-EDTAなどで剥がし細胞の懸濁液を用意する。
(２)細胞懸濁液を遠心分離する(1000 rpm、3 min)。
(３)上清を除きPBS(-)を添加する(この時、細胞数が10⁵から10⁶cells/mlとなるよう調製する)。ピペッティングなどで十分分散させる。
(４)培養液中の血清などに含まれるエステラーゼによりCalcein-AMが加水分解しバックグラウンドが上昇する恐れがあるので(２)、(３)の操作をくり返し行い洗浄を十分行う。
(５)マイクロチューブに細胞懸濁液を200μl入れ、更に色素溶液を100μl入れる。37℃で15 minインキュベートする。
(６)カバーグラス上に(5)の溶液を適宜乗せ、上からもう一枚のカバーグラスを重ね染色溶液を挟みこむ。
(７)蛍光顕微鏡にセットし、まず490±10 nmのフィルターで励起して観察すると黄緑色に染色された生細胞が観察される。また、同時に赤色に染色した死細胞も観察することが出来る。さらに545 nmのフィルターで励起することにより赤色に染色した死細胞のみを蛍光観察することができる。



【色素の最適濃度】
使用するCalcein-AM及びPIの最適濃度は、細胞の種類に大きく依存しているので、使用する細胞毎に最適色素濃度を求める必要がある。以下のようにして、それぞれの細胞毎の最適濃度を求めることを薦める。

(1)目的とする細胞について、0.1％サポニン、あるいは0.1〜0.5％のジギトニンで10分間処理するか、70％エタノールで30分間処理することにより死滅させる。0.1〜10μMのPI溶液にて染色し、細胞質を染めることなく核のみを赤色に染色する濃度域を探し出す。
(2)同様の死細胞を使用し、0.1〜10μMのCalcein-AM溶液にて染色し、死細胞の細胞質を染色しない濃度域を探し出す。更にその濃度域で生細胞が十分染色することを、生細胞を使用して確認する。もし、染色が十分でなければ、濃度を高くして検討する。

【注意事項】
１)-Cellstain- Double Staining Kitは、-20℃以下で冷凍して保存すること。
２)Calcein-AMは湿気により加水分解する恐れがあるので、使用後はキャップはしっかり閉じ水分の吸収に注意すること。
３)調製した染色溶液はその日のうちに使用する。
Calcein-AMは水溶液中では徐々に加水分解するため、バックグラウンドが上昇し観察しにくいことがある。
４)PIは発癌性の疑いがあるので下記の点を参考にして取り扱いには十分注意すること。
　　(１)取り扱い時には手袋・保護眼鏡・マスク等を着用し、接触および吸引しないよう注意する。
　　(２)万一、皮膚に接触した場合は、直ちに大量の水で洗い流す。
　　(３)処理方法
使用した器具の洗浄液などの廃液は、各機関独自の取り扱いガイドラインに従い処理する。あるいは下記処理方法を参考にして分解後廃棄する。
・UV照射や日光にさらし分解する。
・次亜塩素酸ナトリウムにより酸化分解後、中和処理する。

参考文献

１)L. S. De Clerck, C. H. Bridts, A. M. Mertens, M. M. Moens, and W. J. Stevens, J. Immunol. Methods, 172, 115(1994)．
２)E. S. Kaneshiro, M. A. Wyder, Y.-P. Wu, and M. T. Cushion, J. Microbiol. Methods, 17, 1(1993)．
３)N. G. Papadopoulus, G. V. Z. Dedoussis, G. Spanakos, A. D. Gritzapis, C. N. Baxevanis, M. Papamichail, J. Immunol. Methods, 177, 101(1994)．

---

Price List

関連商品

◆生細胞染色蛍光色素

製品名	励起波長	蛍光波長	容量	価格(￥)
Calcein-AM CFSE solution(1mM) FDA	490nm 496nm 490nm 488nm	515nm 512nm 526nm 530nm	1mg 1mg 1ml 1mg	9,600 3,300 27,700 3,300

Calcein-AMを用いた細胞染色の例

(試薬)
・A液
Calcein-AM１mgをDMSO１mlに溶解する。この溶液をストック溶液とする。保存は劣化を抑えるため-20℃にて行う。
・B液(Calcein-AM２μM)
A液をPBS(-)で500倍(２μM)に希釈する(A液10μlを5.0mlのPBS(-)に溶解する)。
＊Calicein-AMは水溶液中で分解するので、B液は用時調製とする。
・PBS(-)

(操作)
１)HeLa細胞をトリプシン-EDTAなどで処理し、細胞の懸濁液を準備する。
２)細胞懸濁液を遠心分離する(1000 rpm, 3 min)。
３)上清を除き、PBS(-)を添加する(この時、細胞数が10⁵〜10⁶ cells/mlになるように調製する。
４)ピペッティングなどで十分分散させる。
＊培養液中の血清などはバックグラウンドを上昇させる恐れがあるので、２)〜４)の操作を繰り返し行い、十分に洗浄する。
５)1.5 mlマイクロチューブに４)で得た細胞懸濁液30μl添加する。
６)さらにB液を15μl添加する。
７)マイクロチューブに蓋をして、37℃で15分インキュベートする。
８)カバーグラス上に７)の溶液10μlを乗せ、上からもう一枚にカバーグラスを重ね、染色した細胞溶液を挟み込む。
９)このカバーグラスを蛍光顕微鏡に置き、490nmのフィルターで励起させ、黄緑色の蛍光を発する生細胞を観察する(フィルターについては490±10nmのものであれば良好に観察することができる)。

CFSEを用いた細胞染色の例
(試薬)
　CFSE１mgをDMSO１mlに溶解する。この溶液をストック溶液とする。
ストック溶液をPBS(-)で1000倍(２μM)に希釈する(ストック溶液10μlを10mlのPBS(-)に溶解する)。
(操作)
上記試薬溶液を用意し、Calcein-AMの場合と同様の方法で染色を行った。

BCECF-AMを用いた細胞染色の例
(試薬)
1mM BCECF-AM stock solution
　　0.6886mg/ml(DMSO)
上記溶液をPBS(-)緩衝溶液にて500倍(２μM)に希釈する(ストック溶液10μlを５mlのPBS(-)に溶解する)。
(操作)
上記試薬溶液を用意し、Calcein-AMの場合と同様の方法で染色を行った。

FDAを用いた細胞染色の例
(試薬)
FDA１mgをDMSO1mlに溶解する(ストック溶液)。
PBS(-)緩衝溶液にて希釈し、２μMとする。(ストック溶液4μlを５mlのPBS(-)に溶解する)。
(操作)
上記試薬溶液を用意し、Calcein-AMの場合と同様の方法で染色を行った。

◆死細胞染色蛍光色素

製品名	励起波長	蛍光波長	容量	備考	価格 (￥)
PI EB DAPI	488 510 390	610-620 595 460	1mg 1mg 1mg	DNA, RNA	2,900 2,900 4,500

◆死細胞染色色素

製品名	(極大)吸収波長	容量	価格 (￥)
Trypan Blue	606	5g	2,900

◆核染色蛍光色素

製品名	励起波長	蛍光波長	容量	備考	価格 (￥)
AO	488 488	515-575 620-650	1mg	二本鎖DNA 一本鎖	2,900

○詳細はHomepage(http://www.dojindo.co.jp/whatsnew/intro/japanese/index.html)に最新情報掲載中です。
○試薬は和光純薬工業�M系販売店で入手可能です。
○上記商品に関するお問い合わせはフリーダイヤル(0120-489548)またはフリーファックス(0120-021557)にて弊社マーケティング部へどうぞ。