ジチオカルバメート化合物による in vivo NO イメージング／高いＮＯ消去活性と耐還元性を持つリポソーム化ＰＴＩＯ誘導体

　　　　　　　　　　　　(株)同仁化学研究所　宮崎　公徳

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　生体内での情報伝達、免疫、弛緩、恒常性維持、疾患など様々な場面にNOが関与し、その重要性が注目され始めて10年がたとうとしている。その多彩な役割と作用機序が徐々に解明されるにつれ、NOを含む巧妙な生体機能が明らかになりつつある。そのような中で昨年、生体系でのNO検出、定量、あるいは画像化を可能にする報告がなされた。一つはジチオカルバメート-鉄錯体をNOトラッパーとして用いたESRによるNOイメージング法であり、もう一つは従来のCarboxy-PTIOを凌ぐNO消去活性をもちながら、還元剤による失活や毒性をおさえたリポソーム化PTIOである。いずれも生体系でのNOの動きを検出、画像化したり、NOを消去、定量する方法として興味深いのでご紹介したい。

１．ESRによる内因性NOの検出およびイメージング

【はじめに】
　N-メチルグルカミンジチオカルバメート(MGD)やジエチルジチオカルバメート(DETC)などのジチオカルバメート化合物は鉄イオン、銅イオンなどと錯体を形成し、特にこれらの鉄錯体はNOの選択的トラッパーとして、これまで広くNO研究に用いられて来た。ここまでは生きたマウスで誘導型NO合成酵素(iNOS)から産生されたNOをジチオカルバメート-鉄錯体によってトラップし初めてESRイメージングに成功した吉村らの報告¹⁾について紹介したい。れr分子生物学用 buffer は昨年11月に開催された第７回フォーラム・イン・ドージン『いのちの画像化をもとめて』でも講演されたので、その内容も補足してESRによるNOの画像化について紹介する。

【ジチオカルバメート錯体によるNOトラップ】
　1991年にVaninらはDETCの鉄錯体が生体内のNOトラップ試薬として有用であることを報告している²⁾。DETCは鉄と２：１錯体を形成し、NOを捕捉して鉄-ニトロシル錯体を形成する。これを用いてNO放出試薬やseptic shock時³⁾、脳虚血時⁴⁾等のNOがESR法によって研究されてきた。しかしDETCは水溶性であるが、その鉄錯体(Fe-DETC)は水溶性が低いためイースト膜にロードして投与するか⁵⁾、鉄塩とDETCを別々に投与するなどの工夫が必要であった。そこでLaiらは水溶性のMGDに着目し、この鉄錯体をNOトラップ剤とし、ニトロプルシッドを投与したマウスのin vivo ESR⁶⁾、リポ多糖(LPS)投与時のショック時に産生するNOのin vivoでの検出を報告している⁷⁾。LaiとKomarovは MGD-Fe錯体を用いて初めて生きたマウスの尻尾での内因性のNOをS-band ESR(3.5GHz)によって検出している⁷⁾。吉村らが用いた(N-Dithiocarboxy)sarcosine(DTCS)は従来Znの比色分析における、Cuなどのマスキング剤として用いられて来た^8,9)物質であるが、その鉄錯体Fe-DTCSが水溶性でありNOと錯体を形成したNO-Fe-DTCSも水溶性となるため、始めから鉄錯体Fe-DTCSを投与することができるという長所を持つ。(DTCS錯体はMGD錯体よりも水溶性が高い。)そこでFe-DTCSをNOトラッパーとして用いることによって、マウスの腹腔内にLPS投与で誘導されたiNOSからのNOをトラップしESRイメージングを行った。ただしDTCSは従来のアンモニウム塩ではマウスでLD₅₀=765mg/kgと毒性が高いため、吉村らは毒性の低いナトリウム塩のDTCS(LD₅₀=1942mg/kg)を用いている⁹⁾。
通常のX-band(９GHz)のESRで用いられるマイクロ波では水による誘電損失が大きく、容量の大きい生体試料ではマイクロ波が内部まで入り込めない。このため生体試料では1.5GHz以下のマイクロ波を使用したL-bandのESRが有利である。このL-band ESRにMRIと同様、均一な外部磁場に磁場勾配を加えることでイメージ像の基となるESR信号を得ることができる。
水溶性のFe-DTCSとNOによって生成したNO-Fe-DTCS錯体はL-band ESRで700MHzに、DETCやMGDと同様のニトロシルFe錯体の窒素の核スピンに基づく鋭い３本線を与える(Fig.2a)。DTCSは他のジチオカルバメートに比べて、空気中、溶液中でかなり安定であるので¹⁰⁾、水溶性のFe錯体は生化学的にも有利なスピントラップ剤である。
一方で内因性のNOとして、最も多量に存在するのは炎症などの要因となるiNOSから産生されるNOである。大腸菌由来LPSを投与すると種々の細胞、マイクロファージ、血管平滑筋などでiNOSが発現することが知られている。iNOSの過剰発現をもたらすLPSの投与はヒト及び動物でseptic shock様の症状を引き起こす^11,12)。
そこでまずNO-Fe-DTCS錯体水溶液(50mM、６ml)をWistar系雄性ラットの腹腔内に投与し、35分後にその頭部から水溶液の場合と同様のシグナルを観測することができた(Fig.2b)。

　これは錯体が途中の組織や蛋白質とあまり相互作用することなく、血流にのって頭部まで拡散したことを示している。このスペクトルをもとにこのマウスに磁場勾配を加えてイメージングを行ったところ血流量の多い腹側に多くの錯体が集まった画像Fig.3を得られたが、脳部位には錯体がほとんど分布していないことからこの錯体は血液−脳関門を通過できないと考えられる。
次にマウス腹腔内にエンドトキシンを投与しiNOSを誘導し、septic shockモデルを作り、Fe-DTCS錯体を用いてiNOSから産生された内因性のNOのESRイメージングを試みている。
エンドトキシンとして大腸菌由来のリポ多糖(LPS 10mg/kg)を用い、腹腔内に投与して5.5時間後にFe-DTCS錯体([Fe]=300mM;[DTCS]/[Fe]=3; 10ml/kg saline soln.)を皮下注射して投与した。Fe-DTCS錯体の拡散とNOとの錯体形成のため３時間経過後にマウスの腹部でのESR測定を行った。マウスは周波数700MHzのEPRイメージングシステムの共振器の中心のサンプルホルダーに固定し、37℃でESRシグナルを得た。Fig.2cに示したESRスペクトルは溶液中のNO-Fe-DTCSのESRスペクトルFig.2aと類似しており、これは投与されたFe-DTCSが内因性のNOと反応しマウスの腹部でNO-Fe-DTCS錯体を形成していることを示している。NO-Fe-DTCS錯体のシグナルはFe-DTCS投与３時間後と４時間後で同様の強度、パターンであることから、生じたNO-Fe-DTCS錯体はin vivoで安定であると言える。このシグナルを基に得られたイメージ像がFig.4であり、生きたマウスの腹部(ZX面)交差部の２次元EPRプロジェクションである。マウスの右腹部が下になった三日月形に分布した像を示している。イメージ像の輪郭は肝臓に対応し、強度の強い部分は軸方向のプロジェクションでの肝臓の厚い部分に対応している。このESRシグナルはLPSのかわりに生理食塩水を投与した場合には観測されず、また、LPS投与の直後、２時間後、４時間後にNO合成酵素阻害剤であるL-NMMA(50mg/kg saline soln.)を投与した場合にはNO産生が抑制されシグナルは観測されなかった(Fig.2d)。従ってこれらの結果から、１)シグナル観測にはLPS投与が必要であること、２)NOS阻害剤によって抑制されるのでシグナルがiNOSからのNO由来であることを示している。



Fig 4　Two-dimensional (2D)ESR projection of a cross section (ZX-plane) of the abdominal region of an LPS-treated mouse. Instrument setting were similar to those described in Figure 2. Signals lower than 25% of the maximum signal level in intensity were regarded as noise. The image was reproduced in 256 color levels. The mouse was treated in a manner similar to that shown in Figure 2B (and described in the Experimental protocol). The spatial resolution was 6.3 mm.

　さらに様々な組織でのNOアダクトの分布を調べるために、LPSで刺激したマウスの組織ホモジネートのESRを測定した。組織ホモジネートのESRでは肝臓、腎臓、全血、尿でシグナルが観測され、イメージ画像の高強度の部分は、マウスの肝臓の部位に相当することが確認された(Table１)。

Table 1. Distribution of NO-Fe-DTCS complex in various tissues of LPS-treated mice.

Tissue	NO-Fe-DTCS complex*
Liver Kidney Whole blood Urine	96.0±10.8 nmol/g (wet tissue) 19.8±1.3 9.4±1.5 nmol/ml 13.8±2.6

*Data are presented as a mean ± SE of those for samples from six mice.

一方で脳と脾臓ではシグナルは観測されなかった。特に肝臓でのシグナルが強かったことから、このNOアダクトが肝臓に集まり易いことを示しているが、これはDETC¹³⁾やMGD⁷⁾のFe錯体を用いた研究と一致しているが、DTCSはNOの捕捉効率の点でProDTCやMGDよりも優れている¹⁴⁾。
　このin vivo ESRイメージングは局所的に高濃度に分布するNOの挙動を調べる非侵襲性の方法として非常に有用で今後の発展が期待される。

２．リポソーム化PTIO誘導体によるNO定量
　Carboxy-PTIOはNOと反応してNO₂へと変換する水溶性の選択的NO消去剤である¹⁵⁾。赤池らはこのPTIOを修飾しリポソームに包埋することによって、生体内のアスコルビン酸などの還元剤による失活を防ぎ、安定性を大きく向上させる方法を報告した¹⁶⁾。ここではこのリポソーム化PTIOによる in vitro、及び細胞培養系でのNO消去法について紹介したい。なおここではこのPTIO誘導体をTMA-PTIOと呼び、それをリポソームに包埋したものをリポソームPTIOと呼ぶ。
【はじめに】
　Carboxy-PTIOは赤池らと同仁化学研究所との共同研究によって開発された安定な有機ラジカルで、Fig.5及び式(1)に示したようにNOと1.0 x 10⁴M^-1S^-1で反応してNO₂を生じる¹⁵⁾。
　しかしながら生体内ではアスコルビン酸、チオール、さらにスーパーオキサイドアニオンと反応して還元されラジカルを消失してNO酸化能が無くなり、ESRでも検出されなくなる。1994年にWoldmanらはリポソームにnitronylnitroxyl radicalを包埋することでその安定性を向上できることを報告している¹⁷⁾。赤池らは逆相法によりL-α-phosphatidylcholine(PC)(Sigma)、Dimyristoylamido-1,2-deoxyphosphatidylcholine(DDPC)(同仁)を用いてリポソームを作成し、Carboxy-PTIOよりリポソームに包埋されやすくしたTMA-PTIOをリポソームに包埋させた。
PC誘導体であるDDPCをユニラメラリポソームに添加することによって生体内での膜安定性を向上させ¹⁸⁾、水溶液で４℃で１ヶ月保存した場合も80％以上のTMA-PTIOがリポソーム内に残っていることが確認されている。リポソーム膜の安定性が向上し、さらに脂質膜によって種々の還元剤によるPTIOの失活を抑制できることを示している。さらにPTIO及びCarboxy-PTIOは100μM以上ではHeLa細胞に対して細胞毒性を示し、増殖阻害を起こしたのに対し、リポソーム化されたTMA-PTIOは、赤池らの系では顕著な細胞毒性を示さなかった。これはリポソームPTIOをNO検出系に用いた場合、特に有利である。
TMA-PTIOをリポソーム化することによってPTIOとPTIのESRスペクトルの線幅はFig.8とFig.10に示したように幾分ブロードになるが、他のESRパラメータ、例えばg値やhfcは影響されない。従ってリポソーム内で生成したTMA-PTIのESRシグナルは従来のCarboxy-PTIOの場合と同様に容易に区別でき、そのシグナルを２重積分することによって、系内で発生したNO量を見積もることができる。
【NOドナーからのNOの定量】
　Fig.9にはCarboxy-PTIOおよびリポソームPTIOを用いて、NOからNO₂への変換効率を示している。ここでNOドナーとして用いたPropylamine NONOateはNOC７とも呼ばれ、中性pHの溶液中で半減期５分の速度で１分子のNOCから２分子のNOを自発的に放出するNOドナーである¹⁹⁾ 。NOC７から放出されるNOをCarboxy-PTIO及びリポソームPTIOで捕捉し、生成したCarboxy-PTIまたはリポソームPTIをESRによって検出した。NOC７の濃度に対して生成したCarboxy-PTI及びリポソームPTIの濃度をプロットすると傾きは２となり、１分子のNOC７から２分子のNOが発生し、同量のPTI類を生じていることを示唆した。しかしながらNOCの濃度が高い領域では、PTIO類によって生じたNO₂がNO分子と反応してN₂O₃を生じる(式２)ために、プロットの傾きは２よりも小さくなってくる。この傾向はCarboxy-PTIOでより顕著に現われ、リポソームPTIOではより高濃度域まで直線性が保たれている。Fig.9Bに示したように予想されるNO濃度より３倍以上のPTIOを用いた系では傾きは2.02となり(r²=0.995)、化学量論通りNOC７の１分子から２分子のNOが放出されていることが証明された。

　・ＮＯ　＋　・ＮＯ_２　→　Ｎ_２Ｏ_３　　　　　(2)

　これはNOC７から放出されたNO分子がその疎水性によってリポソーム脂質膜中に集まり易く、同時にTMA-PTIOによって生じたNO₂が、脂質膜内に留まるために式(2)に示した競争反応が起きにくいためと思われる。従って脂質膜は１)TMA-PTIOを還元剤から守るのみならず、２)その脂質膜中に疎水性の高いNO分子が集まり易い場を提供し、３)生じたNO₂とNOとの競争反応を抑える効果を持つ。

【細胞からのNOの定量】
　次に、赤池らはリポソームPTIOが細胞から生じたNOと反応し消去できるかを検討した。リポソームPTIOを成熟マクロファージ細胞(RAW264)と、LPS及びマウスrecombinantγ-interferon(IFN-γ)の刺激存在下、非存在下でインキュベートした。リポソームPTIOのESRシグナルは、アスコルビン酸やチオール等の還元剤、fetal bovine serum(FBS)の存在下でRAW264とインキュベーションしても数時間安定であった。
Fig.10Aに示したように、NOとの反応によって生じるリポソームPTIの生成は容易に検出、定量できる。
Cu, Zn-SODをリポソーム溶液に添加し、系内で産生するスーパーオキシドを除去すると、リポソームPTIの生成は増大した。スーパーオキシドはNOと迅速に反応してスーパーオキシナイトライトに変換するため、もはやPTIO類と反応できなくなるが、SODでスーパーオキシドを除去すると、この損失を防ぐことができる。
L-arginineを枯渇させるか、NOS阻害剤であるL-NMMAを添加すると、Fig.10Aに示したようにリポソームPTIの産生は阻害されるので、リポソームPTIOは真に細胞のNOSから発生したNOを捕捉していると言える。
Fig.10BはリポソームPTIO/ESR法によって測定したNO産生のタイムプロフィールであり、これはノーザンブロットで検出したiNOSのmRNAのそれと相関している。(データ省略)
【感度及び特異性】
　リポソームPTIOによるESR測定をNOの定量に用いる場合、検出限界は使用するESR装置の感度に依存する。S/N比はPTIOやPTIの場合、繰り返し磁場掃引とコンピュータ処理によって大きく改善できる。容量180μlの石英偏平セルでJEOL製X-band ESRとデータ分析システムを用いてPTIOとPTIのESRスペクトルを測定した場合、PTIOまたはリポソームPTIOとNOとの反応系で生じたPTIの最小検出限界は0.05μM以上(絶対値で９pmol以上)である。これはGriess試薬²⁰⁾を用いたNO₂⁻の比色による検出よりも20倍高感度である。NO産生量を正確に見積もるためには、系に加えるリポソームPTIOの量は産生するNOの濃度域を正確にカバーする量であることが重要である。またリポソームは１カ月以上安定で、細胞毒性もない。
赤池らの系ではリポソーム膜は種々の極性、水溶性還元剤からPTIOを守り、疎水性の小さいNOだけを通してリポソーム内のPTIO成分に到達させる機能を果たした。PTIO類からPTI類を生じる化学反応は特異的であり、他にPTIOと反応してPTIを生じる物資はNO以外に現在のところ知られていない。さらにPTIOは直接NOと反応するNO関連物質分子、例えばニトロソチオール(RS-NO)、鉄-ニトロシル錯体、亜硝酸(NO₂⁻)とは反応しない。
【まとめ】
　生化学的な系で産生したNOを特異的、高感度に定量できる系がリポソームPTIOとESRを組み合わせることで可能となった。リポソームPTIOは１カ月以上安定で、細胞毒性もなく、優れた消去活性を持つため、特異的なNOスカベンジャーとして今後広く用いられるものと期待される。

参考文献

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