新製品
グルタチオン分別定量キット GSSG/GSH Quantification Kit

　グルタチオン(γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine)は生体内に存在するトリペプチドで、Glutathione Peroxidase、Glutathione S-TransferaseおよびThiol Transferase等の酵素基質として抗酸化や薬物代謝などに関与しています。グルタチオンは通常、生体内で還元型（GSH）として存在しています。しかし、酸化ストレスなどの刺激によって還元型（GSH）から酸化型（GSSG）に変換されるため、GSHとGSSGの比率が酸化ストレスの指標として注目されています。小社では総グルタチオン量を定量するためのキットTotal Glutathione Quantification Kit（品コード：T419）を販売しておりますが、GSSGおよびGSHをそれぞれ定量したいという要望が数多く寄せられました。そこで、このたびGSHとGSSGを分別定量できるキットを開発致しました。本キットには、GSHを隠蔽するためのマスキング剤が含まれています。このマスキング剤をサンプルに添加することによって、サンプル内のGSHのみを隠蔽することができます。その後、酵素リサイクリング法を用いたDTNB（5,5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)）の発色（λ_max = 412nm）を測定することによってGSSGのみを定量することができ、別途測定した総グルタチオン量からGSSG量を差し引くことでGSH量を求めることが可能です。なお総グルタチオンの測定範囲は0.5〜50μmol/l、GSSG の測定範囲は0.5〜25μmol/lとなっております。

　次頁に本キットを用いて赤血球中及びHL-60細胞の前処理例を示します。 本キットを用いることによって、これまで困難であったGSSGとGSHをそれぞれ簡便に定量することが可能です。 本キットはグルタチオンを指標とした生体内の酸化ストレス状態の解析に有用です。

測定原理

キットの使用方法（エンドポイント法）

試料調製：GSSGとGSHの測り分けを行う場合、測定試料はあらかじめ同一のものを2つ（200μlx2）準備する。

GSSG測定用：測定試料200μlをマイクロチューブに入れMasking solutionを4μl加え、ボルテックスミキサーを用いて混合する（Sample A）。

総グルタチオン測定用：測定試料200μlを準備する（Sample B）

※注意：測定試料中のグルタチオン濃度がわからない場合、測定試料を希釈したものを数種類調製してから測定してください。

測定

1) GSSG, GSH standard solution 及びSampleAあるいはSampleBを40μlずつ、各wellに入れる。

2) Buffer solution 120μlを各wellに加える。

3) 37℃で1時間インキュベートする

4) Substrate working solution 20μlを各wellに加える。

5) Coenzyme working solution 20μlとEnzyme working solution 20μlを各wellに加える。

6) 37℃で10分間インキュベートする。

7) 405nmもしくは415nmのフィルターを使い、マイクロプレートリーダーで各wellの吸光度を測定する。

8) 測定試料（SampleA）中のGSSG濃度をGSSG検量線（Fig.1）より求める。

9) 測定試料（SampleB）中の総グルタチオン（GSH+GSSG）濃度をGSH検量線（Fig.2）より求める。

10) 求めた総グルタチオン（GSH+GSSG）濃度とGSSG濃度より、下式を用いてGSH濃度を算出する。

赤血球のサンプル前処理例

1) 抗血液凝固剤（ヘパリン）を加えた血液を、1,000 xgで10分間4℃にて遠心する。

2) 上清を捨て、4倍量の5% 5-スルホサリチル酸（SSA）で溶血する。

3) 8,000 xgで10分間4℃にて遠心する。

4) 上清を新しいチューブに移し、純水にてSSA濃度が0.5〜1％になるように希釈したものを測定試料とする。

細胞（HL60細胞：5×10⁶cells）のサンプル前処理例

1) 細胞を200xgで10分間4℃にて遠心する。

2) 上清を捨て、300μlのPBS bufferで洗浄後、200xgで10分間4℃にて遠心する。

3) 上清を捨てた後、10mmol/lのHClを80μl加え、凍結と溶解を2回繰り返して細胞膜を破壊する。

4) 5%SSAを20μl加え、8,000xgで10分間遠心した。

5) 上清を新しいチューブに移し、純水にてSSA濃度が0.5〜1％になるように希釈したものを測定試料とする。

※測定試料中のSSA濃度が1％を超えると測定に影響がでますので、0.5％〜1％になるよう純水で希釈して下さい。

※操作に必要な試薬類（5-スルホサリチル酸（SSA）、エタノールは除く）は、キットに含まれています。

＜キット内容＞
Enzyme solution 50μl × 1本 　 Coenzyme 2本 　 Buffer solution 60ml × 1本 　 Substrate (DTNB) 4本 　 Standard GSH 1本 　 Standard GSSG 1本 　 Masking reagent 20μl × 1本

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