名古屋大学大学院医学系研究科 川本文彦
地球温暖化の影響により熱帯域が拡大していくにつれ、今まで 日本とは無縁と思われていたマラリアが、身近な問題としてク ローズアップされる日も近いのではないかと思われる。今回は、そ のマラリア発生地域に深く関係のあるG6PD異常症およびそのス クリーニング方法に関して紹介したい。
G6PD異常症（G6PD Deficiency）とは、グルコース6リン酸脱水素酵素(G6PD)の活性が著しく低いため、酸化作用を防御す る還元型グルタチオン(GSH)の補充が不十分となり、ヘモグロビ ンの変性によるHeinz小体の形成、細胞膜の透過性異常の結果、主 として血管内溶血をきたす疾患である。平素は無症状であるが、感 染などで薬剤服用後、ヘモグロビン尿を主症状とする溶血発作、黄 疸、貧血を呈する。酵素異常による溶血性貧血では最も頻度が高 い疾患である。
G6PDの構造を決定する遺伝子はX染色体に存在する。した がって、母親から異常な遺伝子を受け継いだ男児に発症する。女 性でもホモ接合であれば発症するが、ヘテロ接合では正常酵素を 持った赤血球と異常酵素を有する赤血球が種々の割合で混在する ため、全体の活性は個人差が大きく、一般には無症状となる場合 が多い。
世界中ではおよそ4億人がG6PDの異常遺伝子を持っていると みなされている。地理的分布に特徴があり、アフリカ、地中海沿 岸諸国、東南アジアの頻度が高い。人種的にはクルド系ユダヤ人 男性の50％、アフリカのバンツー人の20％、アメリカ黒人の10 〜15％、ナイジェリア人の20％、北ヨーロッパ白人の0.1％以下 など偏りが顕著である。日本における頻度は0.1％以下とみなされ ている。
本症はマラリアと深い関係にあり、本症の分布とマラリアの流 行地域の地理的相関から、この疾患はマラリアの自然淘汰により 有利な形質として選択された結果と想像されている。特に、G6PD 異常症の熱帯熱マラリア原虫感染に対する抵抗性は、疫学的な相 関と人工培養での研究からも推察されている。しかしながら、最 近の疫学調査では、G6PD異常症とマラリア感染防止の間には相 関がないと結論している報告1)もある。
三日熱マラリア感染の根絶療法薬として、また、熱帯熱マラリ アの生殖母体による伝播を防止するための薬としても使用されて いるものにプリマキンがある。しかし、このプリマキンがG6PD 異常症患者に対して溶血性貧血を引き起こす。この溶血性貧血は 医学的に重大な問題であり、また、マラリア対策における化学療 法活動においても制限を与える結果となっている。従って、マラ リア対策プログラムが開始する前に、地域住民のG6PD異常症を 前もって把握することが大変重要となっている2) 。
G6PD異常症の診断には、今日までに多くの方法が発表され、蛍 光スポット法3,4)、ホルマザン基質の3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)- 2,5-diphenyl-2H tetrazolium bromide（MTT）と発色試薬の phenazine methosulfate（PMS）を使ったホルマザン法5,6,7) などが知られている。しかし、いずれの方法でも村落の現場で実際 に応用するには種々の問題を抱えている。特に、蛍光スポット法 は最も良く知られた方法で、簡便かつ迅速な方法の一つである。し かし、本法は紫外線ランプと電気を必要とすることが主たる欠点 である。即ち、多くのマラリア流行地などの辺鄙な地域では電気 が供給されておらず、たとえ供給されていても夕方以降のみであ ることが多い。また、この方法では、片方のX遺伝子のみが異常 であるヘテロ接合体の女性（50%前後の活性を有する）のG6PD 異常症の検出は極めて難しい8)。本症は、父親のみならず母親から も子供に伝わる遺伝子疾患であるため、ヘテロ接合体の女性異常 者の検出も重要となる。
一方、MTTホルマザン法では、MTTがヘモグロビンと反応す るため、これが普及できない主要な問題の原因ともなっている。即 ち、血液とMTTを直接反応させないようにするため種々の工夫が 行われてきたが、そのために診断キットの作製に多大な時間や研 究室的な作業が必要となっている。これらの方法の中では、 DEAE-Sephadexを担体とした方法7)は、全く機器を使用せず、 視認で判定する方法で大変優れた方法である。しかし、ゲルの作 製に多量の緩衝液と多大な時間を必要とし、10%以下の活性であ れば検出が容易であるが、20-50％程度の欠損者の検出は難しい。 また、使用されている試薬のPMSが強い光感受性であるため、判 定の正確性に問題がある1)。更に、これまでに報告されたホルマザ ン法を利用したG6PD異常症の診断では、産生されたホルマザン が非水溶性であるため、G6PD活性の定量的測定はかなり難しい という欠点を持つ。
筆者は、新しいホルマザン基質である2-(2-methoxy-4-nitrophenyl) -3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium monosodium salt (WST-8)がヘモグロビンと反応せず、産生されたホルマザンも高度に水溶性であり、MTTとは異なって いることに着目し、G6PD異常症診断への応用を試みた。そして G6PD酵素で産生されたNADPHの測定に、WST-8を基質として水溶液中で使用することが可能となった （Fig 1）。WST-8のホルマザンは460nmに最大吸収を有し、強い橙色を呈するため発 色結果を視認で確認できる。従って、マラリア流行地のような電 気が供給されていない地域でも、電気や高価な機器類を一切必要 とすることなく、その場で目視による診断ができることになる。更 に本法は、MTTホルマザン法では測定できなかった20-50％程度 の欠損者に対しても目視で診断できるようになった（Fig 2）。また、電気が供給されている都市部では、ELISAリーダーなどを利 用して、少量の試薬で正確な酵素活性を定量的に測定することも 可能である（Fig 3）。
このようにWST-8をホルマザン基質として使用することで、簡 便かつ高精度のG6PD異常症の診断が可能になった。マラリア発 生地域住民のG6PD異常症を本法で診断される日も近い。
Fig. 1 WST-8を用いたG6PD活性の測定原理
Fig. 2 実際の発色画像
正常血液とG6PD異常症血液を混ぜて得られた種々の酵素活性サンプルを反 応チューブに入れてWST-8にて橙色に発色させた。
各々のチューブには5μlの血液を加えている。
1.血液無添加の陰性対照区
2.基質を抜いて血液を加えた陰性対照区
3. G6PD異常症血液
4〜6.G6PD異常症血液と正常血液を3：1、1：1、1：3の割合で混ぜた 血液の活性
7.正常血液
チューブ1〜3には橙色の発色は認められない。またチューブ4〜5では弱い 発色が認められ、陰性対照区（チューブ1〜3）と陽性対照区（チューブ7）が 容易に区別できる。
Fig. 3 血液サンプルの発色の時間的増大
Fig.2の血液サンプルのG6PD活性を吸光度計で測定した結果。
測定値は5回の繰り返し実験の平均値を示す。室温で30〜60分の反応で、吸 光度の直線的増加が認められる。
1) I. S. Tantular, et al., Tropical Medicine and International Health, 4, 245 (1999).
2) A. Ishii, et al., Japanese Journal of Parasitology, 43, 312 (1994) .
3) E. Beutler, Blood, 28, 553 (1966).
4) E. Beutler and M. Mitchell, Blood, 32, 816 (1968).
5) V. Fairbanks and E. Beutler, Blood, 20, 591 (1962).
6) H. Fujii, et al., Acta Haematologica Japonica , 47, 185 (1984).
7) A. Hirono, et al., Japanese Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 26, 1 (1998).
8) A. Pujades, et al., Int. J. Hematol., 69, 234 (1999).