前回までの「実用的蛍光誘導体化」において、通常用いられて いる蛍光誘導体化について述べてきた。最近、この通常の蛍光誘 導体化に、時間分解や蛍光偏光などの種々の蛍光特性を積極的に 取り込み、感度や選択性の向上を図る試みがなされている。筆者 らは、通常の蛍光誘導体化にエキシマー蛍光現象を導入し、エキ シマー蛍光誘導体化という新しい概念に基づく方法論を考案した。 本法が、生体実試料中の生体成分分析に極めて有効かつ実用性の 高い方法であることを実証したので、本稿で述べる。
一般に蛍光測定は比較的低濃度（1μmol/L以下）で行うので、蛍 光分子同士の相互作用が観測されることは少ない。しかし、特定 の条件下において蛍光分子（基）が近接すると、互いに相互作用 して蛍光の消光（原因は多種）、蛍光共鳴エネルギー移動、励起会 合体の形成・発光などがおこる。これらの蛍光分子間の相互作用 は互いが近接しないと観測されないことから、高分子化合物（蛋 白質、核酸、生体膜など）等及びそれらと相互作用する物質をそ れぞれ蛍光修飾して、形態、動態の解析に用いられてきた。著者 らはこれらの蛍光分子間の相互作用を低分子生理活性物質の誘導 体化と組み合わせて高選択的かつ高感度な分析法の開発を試みて いる。
ピレンなどの多環芳香族が互いに近接するとき、一方が光を吸 収して励起状態となると、他方の基底状態のピレンと会合して励 起会合体（エキシマー）を形成する。このエキシマーからの発光 をエキシマー蛍光という（図1）。エキシマー蛍光は2個のピレン 分子の間でおこる分子間エキシマー蛍光と1,3-ジピレンプロパン のように同一分子内に存在する２個のピレン基の間でおこる分子 内エキシマー蛍光があり、前者は高濃度（一般に1mM以上）でし か観測されないが、後者は低濃度でも観測される。ピレンの場合、 通常のモノマーからの蛍光は375 nm付近に発光極大波長があるのに対して、エキシマー蛍光における極大波長は475 nmへと長波長シフトする。このように、エキシマー蛍光はストークスシフト（励 起極大波長と発光極大波長の差）が大きいという好ましい蛍光特 性がある。これに加えて、従来の蛍光誘導体化では困難であった 対象物質1分子あたり一個の蛍光基が導入された誘導体と複数個 導入された誘導体を分光学的に識別できるであろうことに着目し、 生体ポリアミンをモデルにエキシマー蛍光誘導体化法の開発を試 みた（図2）。この方法では、複数のピレンが導入された目的成分 をエキシマー蛍光検出するとき、試薬自身やモノアミンの誘導体 はモノマー蛍光しか発しないので妨害とならない。
生体ポリアミン（Chart 1参照）は、分子内に2〜4個のアミノ基を有している。従来の蛍光誘導体化法では、生体中の多くのモ ノアミン類（アミノ酸類を含む）も同時に誘導体化されて同様の 蛍光を与えるので、これらとの分離のため試料の前処理やHPLC 分離条件が煩雑にならざるをえなかった。そこで上記のエキシ マー誘導体化を試みた。
誘導体化操作をChart 1に示す。アミノ基用ピレンラベル試薬としてはPSEが市販されており、それをそのまま用いている。この 条件で誘導体化を行った場合に、一級、二級アミンを問わず、全 てのアミノ基にピレンが導入されていることをLC-MSにより確認 している。また、これらの誘導体は全てエキシマー蛍光を発する ことも確認された。
この方法の選択性を検証するために、ポリアミンとモノアミン をそれぞれChart 1に従って誘導体化してHPLCに付し、エキシマー蛍光検出及び比較のためにモノマー蛍光検出したときに得ら れるクロマトグラムを図3に示す。本法で用いるエキシマー蛍光 検出を行った場合には、ポリアミンのピークが観測されているの に対して、モノアミンのピークは観測されず、試薬ピークも比較 的小さくなる（試薬は極めて高濃度であるので、分子間エキシマー 蛍光によるピークが出現している）。それに対してモノマー蛍光検 出では、モノアミンのピークは観測されるが、多くのブランクピー クが出現するので高感度な分析は困難と思われる。以上の高い選 択性に加えて、この方法はオンカラムでfmolレベルの感度も有し ているので、従来法より簡便な前処理で生体試料（血液、尿）中 ポリアミンの定量に適用できると考えている。
塩基性アミノ酸［オルニチン（Orn）、リジン(Lys)］も、ポリア ミンと同様に分子内にある二つのアミノ基をPSEでピレンラベル することによりエキシマー蛍光検出できる。誘導体化は、ポリア ミンの場合より緩和な条件で進行する。高い選択性を活かして、希 釈尿をそのまま誘導体化するだけで、健常人の尿中塩基性アミノ 酸が定量できる（Chart 2、図4）。これら以外のアミノ酸のピークは観測されない。
本法は、ポリアミンや塩基性アミン以外に、基本的には同一分 子内に複数個のアミノ基を有する生体アミン（ヒスタミンなど）や 医薬品（トリエンチンなど）にも適用可能で、すでに実用されて いる。
さらに、アミノ基以外の多くの官能基にも適用できる。次回は、 ジカルボン酸、ポリフェノールなどについて述べる。
参考文献
1) H. Nohta et al., Anal. Chem., 72, 4199(2000) .
2) H. Yoshida et al., Anal. Sci., 17, 107(2001) .
追記）
前回の「実用的蛍光誘導体化8」において、重要な参考文献の記述 を忘れていましたので、ここで改めて紹介させていただきます。
11.2. 糖
1) p-MOED：Y.Umegae et al., J. Chromatogr., 515, 495 (1990).
2) OMB-COCl：H. Nagaoka et al., Anal. Sci., 5, 525 (1989).
11.4. グアニンヌクレオチ(シ)ド
3) PGO：M. Kai et al., Anal. Chim. Acta, 207, 243 (1988).
11.5. ピリジンヌクレオチ(シ)ド
4) Br-DMEQ：M. Yamaguchi et al., Anal. Sci., 3, 75 (1987).
他の項目については、次の文献（総説）を参照いただきたい。
5) Y. Ohkura et al., J. Chromatogr. B, 659, 85 (1984).